海洋放线菌分离方法

关键词：海洋放线菌，分离方法

中图分类号：Q93   文献标识码： A   文章编号：0253-2654(2006) 06-00-0 

海洋占地球表面的70％，那里是一个广阔的立体生物世界。而人们对海洋微生物的研究和利用远远不及陆地。从陆地微生物发现新的高活性物质越来越困难的今天，人们把目光投向海洋是很自然的。Mincer等从Bahamas，Red Sea，Egypt，Sea of Cortez，Mexico等海域采集海底泥样品，分离到上万株 Micromonospores，将其中MAR 1群菌株定为盐生孢菌属 (Salinispora ) ，认为这些物种广泛分布于不同的海域。2005年，Antonie van  Leeuwenhoek杂志用一整期刊登 Bull和Goodfellow主编的海洋放线菌 (Actinibacteria )研究的成果。从 0m一200m深度的采集的样品，有大约 9％的放线菌可以获得纯培养；200m～2O00m，有0.1％ ～17.0％；2O00m～6000m，有0.8％～14％；6000 m以下，仅有0.5％～0.8％可以获得纯培养。在许多海域，海底泥表面的微生物中，放线菌还会占优势，其中小单孢菌科所占比重较大。目前已发现的放线菌还有Streptomyces，Dietzia，Rhodococcus， Salinospora，Marimomyces，Aeromicrobium，Salinibacterium，Verrucosispora，Aureobacterium，Dermacoccus，Kocuria，Xestospongia ． Gordonia，Micrococcus，Brachybacterium，Acidimicrobium，Microthrix等。可见，海洋放线菌是大有开发潜力的微生物资源。 

最近几年的工作证明，从海洋放线菌发现新生物活性物质的几率甚至超过陆生放线菌。从海洋放线菌获得的部分活性物质有gfiseorhodin  A，salinosporamide  A、B，marino ne，lavanducyanin，gutingimycin，salinamide，tetrodotoxin，Pyrostain A 和B，Pyrizinostatin，sporolides A、B，marinomycin A、B，tetracenomycin  D1，Chromomycin A3， Enterocin，Actp henol，maltophilin，echinomycin，antimycin  A，sporaviridin  A1， bafilomycins，filipin，lipomycins，lagosin，aboyssomicins， ikarugamycin，elalomycin，prridindolol，saphenoc  acid ，1-N-methyl-( E，Z )一albonoursin，1，6-dihydroxyphenazine，Bu-4664L等等。 

我国有广阔的领海，但是对海洋放线菌的研究和开发利用都做得很不够。为了研究海洋放线菌的多样性，进一步进行开发利用，首先就要进行分离。下面介绍一些实用的分离方法。 

1 样品采集及处理

为了排除陆地微生物，最好选择远离人类干扰的所谓“ 原始天然海域”作为研究对象。 

一般用斯库巴自携式水下取样器采集底泥或水样。样品置于塑料瓶，4℃保存，4h以内用如下两方法处理：( 1 )1mL底泥，加4 mL无菌海水，55℃  6min ，马上做分离；( 2 )10mL底泥样品铺于无菌培养皿内，真空干燥约24h ，磨细成粉末，稀释后做分离。在取样的同时，要采集足够量的海水。 

也可以将底泥样品铺于无菌培养皿内，25℃～ 28℃自然干燥 5～7d ，磨碎，80℃或120℃干热处理60min。建议用无菌天然海水提取菌体及稀释，涂布于平板。 

2 盐、海水对放线菌生长和分离的影响

很多人的实验证明，海洋放线菌都需要在天然海水或人工海水配制的培养基上才能生长良好。这是设计分离方法及培养基必须考虑的重要因素。 

3 微囊化分离难培养放线菌

海水样品或底泥经上述处理的稀释液，用PBS缓冲液 ( pH7.2)将土样稀释到终浓度为10细胞／mL。取0.1 ml 细胞悬液与0.5mL预热(40℃)的琼脂糖混合。然后将细胞一琼脂糖混合物也加到 15mL细胞乳化剂中，室温下2200r／min乳化1min，随后再在低温下以2200r／min乳化1min，最后油．菌悬液在低温下1100r／min边搅拌边冷却6min。这个过程可获得大约10凝胶微粒。其中大约10％的凝胶微粒含有单个囊化的菌体细胞。单细胞囊化可通过显微镜监测。凝胶微粒注入到含有25mL培养基的无菌层析柱中。层析柱中有两层过滤膜。过滤器可以截流凝胶微粒而使未被囊化的细胞被洗脱，从而防止自由细胞污染柱中的培养池。培养基按13mL／h速度泵入层析柱中，凝胶微粒在柱中至少培养5周，将微菌落喷洒到 96孔培养盘中(培养基见4节)。通过流式细胞仪可将含有菌落的凝胶微粒与自由细胞分开。分检的准确性可以通过显微镜方法证实。为了确定流式细胞仪可以检测到的囊化的最小量的细胞。以从液体培养基中获得的大肠杆菌的一系列梯度 1000,100，and 10为例，细胞按上述的方法分别囊化，稀释培养液中的细胞通过流式细胞仪可直接计数。囊化的细胞在凝胶微粒中培养3h就形成为菌落，凝胶微粒可用流式细胞仪进行分析。用这种方法可以分离到大量未知菌。

4 培养基

( 1 )M1培养基：淀粉10g，酵母膏4g，蛋白胨2g，琼脂18g．天然海水定容至1000 mL。 

( 2 )M2培养基：甘油6mL，精氨酸1g，K₂HPO₄  0.5 g，K₂HPO₄  0.5g，MgSO₄0.5g，琼脂18g，天然海水定容至1000mL 。 

( 3 )M3培养基：葡萄糖6g，几丁质 2g，琼脂18 g ，天然海水定容至1000 ml． 

( 4 )M4培养基：几丁质2g，琼脂18g，天然海水定容至1000mL．

( 5 )M5培养基：琼脂18g，天然海水定容至 1000 mL ．

( 6 )几丁质琼脂：几丁质2g，K₂HPO₄ 0.7g，KH₂PO₄ 0.3 g，MgSO₄ 0.5g，琼脂20g，天然海水定容至1000 mL

( 7 )海藻糖-脯氨酸培养基：海藻糖5g，脯氨酸1g，(NH₄)₂SO₄  1g，NaCl  1g，CaCl₂ 2g，K₂HPO₄  1g，MgSO₄·7H₂O  1g ，复合维生素(维生素B1、核黄素、烟酸、维生素B6 、泛酸钙、肌醇、P-氨基苯甲酸各0.5mg，生物素0.25mg)，琼脂20g，天然海水定容至1000 mL 。 

HV培养基的分离效果也较好。 

5   抑制剂

分离海洋放线菌一般都需要使用抑制剂，建议用放线菌酮(100或50mg／1000 mL )或制霉菌素 (100mg／L )加萘啶酮酸(20～25mg／1000mL)。也可以用放线菌酮 ( 100或50mg／1000mL )或制霉菌加利富平5-1Omg／1000mL 。 

参考文献 [ 略 ]

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