植物组培中常见污染及其预防措施

污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象。组织培养中污染是经常发生的，常见的污染病原是细菌和真菌两大类。细菌污染常在接种1-2d后表现，培养基表面出现黏液状菌斑。真菌污染一般在接种后3d以后才表现，主要症状时培养基上出现绒毛状菌丝，然后形成不同颜色的孢子层。

造成污染的原因也很多，主要有

(1)  培养基及各种使用器具灭菌不彻底

(2)  外植体消毒不彻底

(3)  接种时不严格无菌操作

(4)  接种和培养环境不清洁

(5)  培养容器原因，包括盖子和封口膜等。

材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染，操作人员不严格遵守无菌操作规程也是造成细菌污染的重要原因。培养环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器的口径过大以及封口膜破损等主要引起真菌污染。

 

（1）灭菌要彻底

在组培生产中，各种培养基以及接种过程中使用的各种器具都要严格灭菌。首先是培养基的灭菌，耐高温的培养基需要在121-123℃条件下灭菌20-30min。若出现灭菌时间不足或温度不够，培养一段时间后就会在培养基表面产生细菌性的污染。一些不耐高温的物质，可采取细菌过滤器除去其中的微生物。其次，接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。第三，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗。

（2）选择适当的外植体

要认真地选择外植体，减少外植体上的带菌量。一般多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多；老的材料比幼嫩的材料带菌多；田间生长的材料比温室生长的材料带菌多；带泥土的材料比不带泥土的材料带菌多。

用茎尖作外植体时，应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中，使其发枝。然后以这种新抽的嫩枝作为外植体，可大大减少材料的污染。或在无菌条件下对才采自田间的枝条进行暗培养，从抽出的徒长黄化枝条上取材，也可明显地减少污染。

（3）外植体消毒

外植体上可能附着外生菌和内生菌。外生菌可以通过表面消毒方法杀灭；而内生菌生长的植物材料内部，表面消毒难以杀灭，培养一段时间后，病原菌自伤口处滋生。防治内生菌首先将欲取材的植株或枝条放在温室或无菌培养室内预培养，再在培养液中添加一些抗生素或消毒剂。

（4）环境消毒

不清洁的环境也会使培养的污染率明显增加，尤其是在夏季，高温高湿条件下污染率更高。接种和培养环境要保持清洁，定期进行熏蒸或喷雾消毒。高锰酸钾和甲醛熏蒸效果好，但对人体有一定的伤害，一般每年熏蒸2-3次。平时读接种室和培养室可采用紫外线照射消毒或喷2%来苏尔消毒。臭氧消毒机对环境消毒效果较好，而且使用灵活方便，对人体的伤害也相对较小。

（5）严格无菌操作

在接种时要严格无菌操作，避免人为因素造成污染。为了使超净工作台有效工作，防止操作区域本身带菌，要定期读一过滤器进行清洗和更换。对内部的过滤器，不必经常更换，但每隔一定时间要检测操作区的带菌量，如果发现过滤器失败，则要整块更换。此外还需要测定操作区的风速，通过调压旋钮使操作区的风速达到无菌操作需要的20-30m/min。