植物组培中褐变的原因及其预防措施

褐变是指在组织培养过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也慢慢变褐而死亡的现象。

很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类化合物。在完整植物体的细胞中，酚类化合物和多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。当外植体切割后，切口附近细胞的分割效应被打破，酚类化合物被多酚氧化酶氧化形成褐色的醌类化合物，醌类化合物又会在酪氨酸酶的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，导致组织代谢紊乱，生长受阻，最终逐渐死亡。

（1）植物基因型

在不同植物或同种植物不同基因型的组培过程中，褐变发生的频率和严重程度存在很大的差异，这是由于各种植物所含的单宁及其他酚类化合物的数量不同。一般木本植物的酚类化合物含量比草本植物高，更易发生褐变现象。核桃的单宁含量很高，不仅在接种初期发生褐变，在形成愈伤组织后还会因为褐变而死亡；苹果进行茎尖培养时，不同品种之间褐变的程度也不一样。对葡萄的研究也发现类似情况。

（2）外植体的生理状态

外植体的生理状态不同，接种后褐变程度不同。一般外植体的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也就越容易褐变，成龄材料一般均比幼龄材料褐变严重。

另外切口越大，酚类物质的被氧化面也越大，褐变程度就会更严重。因此外植体的受伤程度对褐变的产生具有明显的影响，伤口加剧褐变的发生。仙客来小叶诱导时，整片叶接种较分成多块褐变要轻。除机械损伤外，各种消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变，对于不易褐变的种类，用升汞消毒后，一般不会引起褐变，若用次氯酸钠进行消毒，则很容易引起褐变的发生。

（3）取材时间和部位

在不同的生长季节，植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶的活性不同。实验表明在苹果和核桃上，冬、春季取材褐变死亡率最低，夏季取材很容易褐变。在取材部位上幼嫩茎尖比其他部位褐变程度低，木质化程度高的节段在进行药剂消毒处理后褐变现象更为严重。

（4）培养基

在初代培养中，培养基中无机盐浓度过高，会引起酚类物质大量产生，导致褐变。BA和KT不仅促进酚类化合物合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增加褐变；而生长素类如NAA和2，4-D可延缓多酚合成，减轻褐变。采用液体培养基纸桥培养；可使外植体溢出的有毒物质很快扩散到液体培养基中，效果也很好。

（5）光照

在采取外植体前，如果将材料或母株枝条进行遮光处理，然后再切取外植体培养，能够有效地抑制褐变的发生。将接种后的初代培养材料在黑暗条件下培养，对抑制褐变发生也有一定的效果遮光抑制褐变的原因主要是由于氧化过程中，许多反应受酶系统控制，而酶系统活性受光照影响。但是，暗培养时间过长会降低外植体的生活能力，甚至引起死亡。

（6）温度

高温促进酚氧化，培养温度越高，褐变越严重，而低温可抑制酚类化合物氧化，降低多酚氧化酶的活性，从而减轻褐变。在15-25℃下培养卡特兰，比在25℃以上时褐变要轻，在17℃以下培养天竺葵茎尖比在17-27℃褐变要轻。

（7）培养时间

材料培养时间过长，会引起褐变物的积累，加重对培养材料的伤害。蝴蝶兰、香蕉等随着培养时间的延长，褐变程度会加剧，甚至在超过一定时间不进行转接，褐变物的积累还会引起培养材料的死亡。

（1）选择适当的外植体

不同时期和年龄的外植体在培养中褐变的程度不同，选择适当的外植体是克服褐变的重要手段。避免在夏季高温季节取材，选择幼苗、褐变程度轻的品种和部位作为外植体。

（2）外植体预处理

对较易褐变的外植体可采取预处理措施，即先用流水冲洗外植体，然后放置在5℃左右的冰箱中低温处理12-14h。消毒后先接种到只含蔗糖的琼脂培养基中培养3-7d，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中，取出外植体用0.1%的漂白粉溶液浸泡10min，然后再接种到合适的培养基上。

（3）筛选合适的培养基和培养条件

降低盐浓度，减少BA和KT的使用，采取液体培养，初期黑暗或弱光条件下培养，保持较低温度（15-20℃）也是降低褐变的有效方法。

（4）添加抗氧化剂和系缚剂

在培养基中添加抗氧化剂，或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养，可预防醌类物质的形成，对易褐变材料的培养有很好的辅助作用。常用的抗氧化剂有抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清蛋白、硫代硫蛋白等。添加1-5g/L的活性炭对酚类物质的吸附效果也很明显。

（5）连续转移

对易发生褐变的植物，在外植体接种后1-2d立即转移到新鲜培养基上,可减轻酚类物质对培养物的毒害作用,连续转移5-6次可基本解决外植体的褐变问题。