植物的器官培养

植物器官培养主要是指对植物的根、茎、叶等器官进行的离体培养。植物器官培养取得成功的事例很多，应用的范围也很广，是植物组织培养中最重要的方面之一。在生产上，植物器官培养具有极其重要的应用价值。首先，通过离体器官培养开发的植物快速繁殖技术，可在短期内提高繁殖效率，加速优良品种和名贵品种的繁殖速度。其次，利用茎尖培养可以得到脱毒的试管苗，解决马铃薯、甘薯、草莓等一些植物品种的退化问题，提高作物的产量和品质。此外，还可将植物器官进行诱变处理，利用器官培养得到突变株，进行细胞突变育种。在理论上，利用器官培养研究器官的功能及器官之间的相关性、器官的分化及形态建成等问题，有助于我们认识植物生命活动的规律，控制植物的生长发育，更好地为生产服务。

由于植物器官的种类不同，所采用的培养方法、培养条件也不一样。对植物器官进行离体培养时，除茎尖能够继续生长外，一般要经过脱分化过程，即首先要经过愈伤组织阶段，再在愈伤组织中，形成分生细胞团，随后分化出器官原基，最终培养形成完整植株。

离体根培养是研究根系生理代谢、器官分化、形态建成的优良实验体系。由于根具有生长速度快、代谢旺盛、变异性小、离体培养时不受微生物的干扰等特点，能够根据研究需要，通过改变培养基的成分来研究其营养吸收、生长和代谢的变化规律。在生产上，通过建立快速生长的根无性繁殖系，可以进行一些重要药物的生产。有些化合物只能在根中合成，必须用离体根培养的方法，才能生产该化合物。此外对根细胞培养物进行诱变处理，可筛选出突变体，从而应用于育种实践。

首先将植物种子进行表面消毒，在无菌条件下萌发，待根伸长后切取长0.5~1.5cm的根尖接种于预先配制好的培养基中。一般根的培养物生长很快，几天后就能发出侧根，可切下进行培养，如此反复，就可得到由单个根尖形成的离体根无性系。培养时一般采用100ml三角瓶，内装40~50ml培养液。如果对离体根进行较长时间的培养观察，就要采用大型器皿，可采用500~1000ml三角瓶进行培养。根据需要可在瓶中添加新鲜培养液继续培养或将根进行分割转移进行继代培养。采用营养液流动培养的方法可防止培养过程中培养基成分变化对生长带来一些影响。

①基本培养基

离体根培养时一般选择无机盐浓度低的White培养基，也可以采用MS、B5等培养基，但必须将其浓度稀释到2/3或1/2。

②基因型

不同种类植物的根对培养的反应不同，如番茄、马铃薯、烟草、小麦等植物的离体根能快速生长，并产生大量健壮的侧根，可进行继代培养而无限生长；萝卜、向日葵、荞麦、豌豆等植物的离体根需较长时间培养，但久之会失去生长能力；一些木本植物的离体根则很难生长。

③营养条件

离体根生长要求培养基中应具备植物生长所需的全部必要元素。在适合的pH条件下，大量元素中硝酸铵是一种理想的氮源。微量元素对离体根的培养影响也很大，如缺硫会使离体根生长停滞；缺乏其他微量元素同样会影响到离体根的生长。蔗糖是双子叶植物离体根培养最好碳源，其次是葡萄糖和果糖。在有些植物中蔗糖的效果甚至比葡萄糖高10倍。在番茄培养时盐酸硫胺素是不能缺少的，否则番茄根的生长将立即停止，在适当的浓度内，它对生长的促进作用与浓度成正比。

④植物生长调节剂

不同植物离体根对生长调节剂的反应有一定的差异，如在樱桃、番茄等的培养过程中，生长素抑制离体根的生长；而在欧洲赤松、矮豌豆、玉米和小麦培养时，生长素促进离体根的生长；黑麦和小麦等一些变种离体根的生长依赖于生长素的作用。GA3能明显影响侧根的发生和生长，加速根组织的老化；KT则能增加根分生组织的活性，有抗老化的作用。

此外其他条件改变也会影响到生长调节剂的作用，如在低浓度蔗糖（1.5%）条件下，KT对番茄离体根的生长有抑制作用，这是由分生取细胞分裂速度降低造成的，与此相反，在高浓度蔗糖（3%）条件下KT能够刺激根的生长。另外，KT能够延长离体根分生组织的活性，起着抗老化的作用，并能与外加GA3和NAA的反应相拮抗，因此，生长调节剂的作用表现出一定复杂性。

⑤pH

在番茄的离体根培养中,采用单一硝态氮源时,培养液pH应为5.2，而当用单一铵态氮源时，pH在7.2为宜。在培养过程中pH的改变会影响到铁盐的吸收，进而影响番茄根的生长速度。使用非螯合态的铁，当pH升高至6.2时，铁盐失效，造成培养液中缺铁。使用Fe-EDTA时，pH为7时，也不会感到缺铁。一般可采用Ca(H2PO4)2或CaCO3作为缓冲剂，以获得稳定的pH。

⑥光照和温度

离体根培养温度以25-27℃为佳，一般情况下离体根均进行暗培养，但也有些植物光照能够促进其根系生长。

 

茎尖培养是切取茎的顶端部分或茎的分生组织进行无菌培养。茎尖是植物组织培养中最常用的材料之一，依茎尖大小和目的可将其分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。茎尖分生组织培养的目的是获得脱病毒植株，要求切取带有1~2个叶原基，大小为0.1~1.0mm的茎尖。普通茎尖培养主要用于植物快速繁殖，茎尖大小为几毫米到几十毫米。此外，茎尖培养还用于品种改良和基础理论研究等方面。

普通茎尖培养进行植物快速繁殖已成为一项较为成熟的技术。由于该技术是在无菌条件下，在较短的时间和较小的空间内，将一个微型个体进行大量繁殖的方法。因此，人们把这种繁殖技术又称为微繁技术。

茎尖培养过程一般包括4个阶段：无菌培养的建立、中间繁殖体的增殖、诱导生根和试管苗的移栽。

①无菌培养的建立

a、取材。

一般来说首选的外植体材料是正在生长的顶芽或侧芽，但一些植物的茎段、鳞茎、块茎、球茎、花茎等同样可以作为快速繁殖的材料，他们可以通过培养产生不定芽而进行繁殖。

b、消毒。

由于植物的种类及材料的来源不同，可采取不同的消毒方法。首先对材料进行流水冲洗，再用70%酒精漂洗几到十几秒钟，然后用0.1%升汞消毒，消毒时间一般在5~8min，对于来自较老枝条上的顶芽和侧芽及有芽鳞片保护的芽消毒时间可长达8~12min，消毒后的材料用无菌水洗3~5次。

c、切取茎尖。

在无菌条件下对植物材料进行常规剥离，将剥离的茎尖及时转入到适当的培养基中培养。一般用于快速繁殖的茎尖材料，比用于脱毒的茎尖组织要大，可带2~4个叶原基或更多。

d、培养基。

目前用于快速繁殖的基本培养基有MS、B5、White等。培养基中B族维生素是维持快速生长所必要的成分，水解乳蛋白或水解酪蛋白有利于许多植物不定芽和不定胚的分化。培养基中生长素与细胞分裂素的比例影响器官发生的方向，植物种类、部位、季节不同，对于植物生长调节剂的反应也不一样。为了使茎尖顺利地发育成健壮完整的植株，重点是生长调节剂的水平。在进行茎尖微繁时，使用3种类型的生长调节剂：第一类是生长素，用得最多的是NAA，其次是IAA；第二类是细胞分裂素，如6-BA、KT，细胞分裂素在促进不定芽产生上效果显著；第三类是GA3，它往往有利于茎尖的伸长和成活，需要的浓度较低，一般为0.1mg/L，浓度太高会产生不利影响。

e、培养条件。

一般光照强度为1000~3000lx，光周期使用连续光照或16h光照8h黑暗。光照不是为了满足培养物光合作用的需要，而是用于植物的光形态建成。培养温度通常在25℃左右，但因植物种类不同，有时也采用较低或较高的温度。在干燥的季节还应注意培养室内湿度的管理，以防培养基内的水分散失过多对培养不利。

②继代培养

为了增加培养物的数量，必须进一步繁殖，使之越来越多。增长使用的培养基对同一材料来说，每次几乎都是相同的。由于培养材料在最适宜的条件下培养，排除了其他生物的竞争，就能够按几何级数增殖。经过连续不断的继代培养，达到应繁殖的数量后，再进入下一阶段进行壮苗和生根。

③生根培养

矿质元素浓度高时有利于发展茎叶，较低时有利于生根，因此，生根培养一般选用无机盐浓度较低的培养基作为基本培养基。MS培养基无机盐浓度较高，在生根时多采用1/2MS或1/4MS。一般生根培养基中要完全去除或仅用很低浓度的细胞分裂素，并加入适量的生长素，如NAA、IBA等。生根培养基中的糖浓度要降低到1..0%~1.5%，以促使植株增强自养能力，同时降低培养基的渗透势，有利于完整植株的形成和生长。

 

①基因型

不同科、属植物要求的条件有很大差别，甚至同一属的不同种间以及品种间，其表现也不一样。但也有另一些情况，即在分类地位相距甚远的若干种植物中，可能恰好可以用完全相同的培养基。

②外植体的大小

培养茎尖材料过大，不利于丛生芽与不定芽的形成，另外，外植体越大也越容易被污染。但外植体也不要太小，非常小的外植体其存活率很低。

③材料的生理状态

一般以春天芽已经膨大，但芽鳞片还没有张开时最为合适。此时，芽生长旺盛，并有芽鳞片保护，里面是无菌的。对于某些需要高温和低温处理或特殊光周期处理才可以打破休眠的块茎、鳞茎、球茎等，常常要处理以后才能剥取茎尖进行培养。

④芽在植株上的部位

对于草本植物来说，使用顶芽或上部的芽，常常比用侧芽或基部的芽容易培养。这可能与它们生长较为旺盛有关，但由于顶芽的数量有限，也常用侧芽作为培养材料。芽在植株上的部位对茎尖培养的影响因不同的植物种类而异，不可一概而论。例如月季等枝条中间部位的芽成活率高，对培养基反应好。

⑤供试植株的年龄

多年生木本植物随着年龄的增加，分生组织、茎尖和芽的培养变得越困难，成年树较幼态树的培养要困难的多。一年生或多年生草本植物，营养生长早期的顶芽、腋芽比营养生长后期的顶芽与腋芽的培养要容易的多。

⑥培养基

生长调节剂是影响茎尖培养的主要因子。不同的基本培养基对茎尖的培养也有一定的影响。因此，在进行茎尖培养研究中，筛选适宜于某品种微繁殖的基本培养基也是非常重要的。

⑦环境条件

在培养的起始期和茎芽的增殖期，光照可满足植物的形态建成过程的需要。在生根阶段适当增加光照可使小植株具有进行光合作用的能力，由异样型过渡到自养型，并使植株坚韧，提高抗逆性，提高移栽成活率。

 

 

叶的培养是对叶原基、子叶、叶的组成部分等叶组织进行的离体培养。叶是植物进行光合作用的器官，也是某些植物的繁殖器官。离体叶培养主要用于研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题；也可利用离体叶组织建立植物体细胞迅速无性繁殖系，提高某些不易繁殖植物的繁殖系数。此外，叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统，经过自然变异或者人工诱变处理可筛选出突变体在育种实践中加以应用。

①取材与消毒

选取植物的叶原基、叶片或叶柄等，经流水冲洗干净，经70%酒精消毒后，用0.1%升汞消毒5~8min，一般幼嫩叶的消毒时间宜短些，再用无菌水冲洗3~5次。消毒后的叶片转入到铺有滤纸的无菌培养皿内，用解剖刀切成5mm*5mm左右的小块，然后上表皮朝上接种于固定培养基上。

②培养

叶培养常用的有MS、B5、White、N6等基本培养基。附加物中碳源一般都使用蔗糖，浓度为3%左右。生长调节剂是影响叶组织脱分化和再分化的主要因素，对大多数双子叶植物的叶来说，培养中细胞分离素特别是KT和BA有利于芽的形成，而生长素有利于根的发生，添加2，4-D有利于愈伤组织的形成。此外，还需添加椰子汁等有机添加物，以利于叶组织中的形态发生。

叶组织一般在25~28℃条件下培养，光照12~14h/d，光照强度为1500~2000lx，不定芽分化和生长期应将光照强度增加到3000~10000lx。

①基因型

不同的植物种类在叶组织培养特征上有一定的差异，同一个物种的不同品种间叶组织培养特性也不尽相同。

②植物生长调节剂

植物生长调节剂在植物叶组织培养中起着重要作用，叶组织一般要经过愈伤组织阶段，即经过脱分化与再分化过程。其器官形成符合生长调节剂比例控制器官发育模式。例如许智宏（1986）在烟草叶片培养中发现，低浓度NAA与不同浓度的BA配合或BA单独使用均能形成大量的芽，以含有NAA者茎叶生长较好，且很少有根的形成，反之则明显地促进根和愈伤组织的形成。

③植株的叶龄

一般个体发育早期的幼嫩叶片较成熟幼嫩叶片分化能力高。

④其他因素

极性也是影响某些植物叶组织培养的一个较为重要的因素。烟草一些品种离体叶片若将背叶面朝上放置时，就不生长、死亡或只形成愈伤组织而没有器官的分化。

对离体叶片进行的损伤有利于愈伤组织的形成。大量的叶片组织培养证明，大多数植物愈伤组织首先在切口处形成，或切口处直接产生芽苗的分化。但是，损伤引起的细胞分裂活动并非上诱导愈伤组织和器官发生的唯一动力。一些植物（如秋海棠）还可以从没有损伤的离体叶组织表面大量发生。

①外植体直接产生不定芽

叶组织离体培养后，由离体叶片切口处组织迅速愈合并产生瘤状突起，进而产生大量的不定芽；或由离体叶面表皮下栅栏组织直接脱分化，形成分生细胞，进而分裂成分生细胞团，产生不定芽。

②经由愈伤组织产生不定芽

叶组织离体培养后，首先由离体叶片组织脱分化形成愈伤组织，然后由愈伤组织再分化出不定芽；或者脱分化形成的愈伤组织经继代后诱导不定芽的分化。