植物组培中原生质体培养

植物原生质体是去掉纤维素外壁的具有生活力的裸细胞原生质体仍然具有全能性，在适宜的条件下，可经过离体培养得到再生植株。至今已从烟草、胡萝卜、矮牵牛、茄子、番茄等70多种植物的原生质体再生成完整的植株。

原生质体培养在应用研究和基础研究上具有重要意义。第一，与完整植物细胞相比，原生质体易于摄取外来的物质，如DNA，染色体、病毒、细胞器、细菌，因此可利用其作为理想的受体系统进行各种遗传操作，在植物遗传育种实践方面意义重大。第而，由于没有细胞壁，有利于进行体细胞诱导融合和单细胞培养。第三，可用于细胞表面的结构与功能的研究，细胞器结构与功能的研究，病毒侵染与复制机理的研究，以及细胞核与细胞质相互关系，植物生长物质的作用、植物代谢等生理问题的研究。

原生质体培养的基本方法包括：材料的选择与处理、原生质体的分离、纯化、培养、诱导愈伤组织和再生植株。

①材料选择    目前，人们已从多种植物材料中成功分离出植物的原生质体，如叶片、花瓣、子叶、下胚轴、幼根、茎叶、愈伤组织、悬浮细胞等，其中植物原生质体最方便和最普遍的来源是叶片，叶片中的叶肉组织是游离原生质体的一种经典材料。它来源方便，供应及时，当有明显的叶绿体存在时也便于在细胞融合中识别。

②材料预处理   预处理不仅可以提高植物细胞的渗透压，以减少高渗环境的影响，还可以使分离的原生质适应培养条件，提高原生质体的产量和代谢活性等。材料预处理的方法主要有黑暗培养、低温处理、预质壁分离等。

①机械分离法    首先使稀薄啊发生质壁分离，然后用利刃切开细胞壁释放出原生质体。此法的主要缺点是：一是原生质体的产量很低、方法繁琐费力；而是分生组织和液泡化程度不高的细胞不适用。其优点是可避免酶制剂对原生质体的有害影响。

②酶解分离法   植物细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等，细胞之间通过果胶质相连接。酶法分离就是用相应的酶制剂将上述物质分解，以达到分离原生质体的目的。常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、崩溃酶、蜗牛酶等。

a、配制酶液。  在原生质体分离时细胞壁一旦去除，裸露的原生质体若处于内外渗透压不同的条件下，就可能破裂。因此在酶液中必须加渗透压稳定剂，常用的渗透压稳定剂有糖溶液系统和盐溶液系统两种。

b、分离原生质体。  原生质体分离有两种方法。一种是两步分离法，首先把植物材料在果胶酶或离析酶内处理一定时间，使单个细胞分离出来，然后再在纤维素酶中除去细胞壁，最后获得原生质体；另一种是一步分离法，即把一定量的纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶组成 混合酶液，对材料进行一次性处理，得到分离的原生质体。

经酶解处理后得到一个由原生质体、细胞团和细胞碎片组成的混合液，需要进一步纯化。常用的纯化方法有：

a、离心沉淀法   利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先行过滤再低速离心，使原生质体沉淀于试管底部。该方法比较简单，由于原生质体沉淀在一起相互挤压，常引起原生质体破碎。

经酶液处理的原生质体悬浮液用400目网筛过滤后，滤液经500~1000r/min离心5~6min吸去上清液，用一般洗涤液（如一定浓度的甘露醇）或专用洗涤液（0.45mol/L甘露醇，10mmol/L CaCl₂.H₂O,0.7mmol/L KH₂PO₄,pH5.6）重新悬浮离心，如此重复2~3次。最后收集沉积于试管底部的原生质体。

b、漂浮法   应用渗透剂含量较高的高渗溶液使原生质体漂浮于液面。该方法能够获得比较纯净的原生质体；由于存在高渗溶液对原生质体的破坏作用，仅能获得少量的完好原生质体。

首先依照离心沉淀收集原生质体，之后将沉淀用洗涤液（3%蔗糖、0.4mol/L甘露醇、1480mg/L CaCl₂.2H₂O）或用11%~23%蔗糖液洗涤离心（400~800r/min,3~10min）2~3次，收集漂浮在溶液表面的原生质体，最后用培养液洗涤一次。

c、界面法   采用两种比重不同的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度，原生质体即处于两种溶液界面之间。该方法可防止因挤压引起原生质体破碎，原生质体收获量较大。

首先依沉淀法收集原生质体，再用培养液离心沉淀一次，将沉淀置于2~3ml培养液中悬浮。取10ml离心管加入8ml 18%的蔗糖溶液，再取2ml原生质体悬浮液铺于其上，以700r/min离心2min，此时大量原生质体集中于培养液与蔗糖溶液之间，轻轻吸取原生质体，再用培养液离心洗涤一次，即可获得纯净的原生质体。

分离纯化后的原生质体需要检查活力并调整好起始密度后才能进行培养。对于新分离出来的原生质体的活力有以下几种测定方法。

①形态识别。形态上完整，富含细胞质，颜色新鲜的原生质体有活力。若将形态上正常的原生质体放入低渗洗液或培养基中，可见到分离时缩小的原生质体又恢复原态。一般正常膨大的原生质体都是有活力的原生质体。

②活体染色。用0.1%酚番红或Evans蓝进行染色后即进行观察，有活力而质膜完整的原生质体对染料有排斥作用而不被染色，死亡的原生质体能立即被染上色。

③荧光染料活体染色。用双醋酸盐荧光素（FAD）对原生质体进行染色，染料可自由透过原生质体质膜进入内部，进入后由于受到原生质体内酯酶的分解，而产生有荧光的极性物质荧光素，它不能自由出入质膜，并在膜内堆积。在荧光显微镜下可根据产生的荧光，判断原生质体的活力。

①浅层液体培养   此法是将一定密度（约2Χ10⁵个/ml）的原生质体悬浮液移到培养皿或三角瓶中使之形成一个浅层（1mm）并进行培养。注意液层不宜太厚，否则不利于细胞对氧的吸收。培养期间每日需轻轻摇动2-3次，避免分布不均匀并帮助通气。本法的优点是培养基与空气接触面大，通气好，原生质体的代谢物是易扩散，防止了有害物质积累过多而造成毒害。此外，转移培养物或添加新鲜培养基也方便，并便于观察和照相。

②平板法培养   将1ml原生质体密度为4Χ10⁵个/ml的悬浮液，与等体积已溶解的含有1.4%琼脂糖的培养基（40~45℃）均匀混合后，置于直径为6cm培养皿中，此时密度为2Χ10⁵个/ml，待凝固后，将培养皿反转，置于四周垫有保湿材料的直径为9cm的培养皿内。此法得到的原生质体分布均匀，有利于进行定点观察原生质体形成细胞壁和细胞团的全过程。

③双层培养法   为固体培养和液体浅层培养相结合的培养方法。在培养皿内注入适量的固体培养基，再加入与原生质体混合均匀的培养液。此法既具有较丰富的培养基，又不易干枯,并且细胞分裂后可在固体培养基上生长和繁殖.

①细胞壁的再生   分离的健康原生质体在各方面条件都合适的时候,会很快再生出新的细胞壁.因植物种类、取材的器官或组织的不同，细胞壁开始再生的时间也不同。一般情况下，由培养细胞和幼嫩组织分离的原生质体，再生壁开始再生的时间也不同。一般情况下，由培养细胞和幼嫩组织分离的原生质体，再生壁开始得比较早，而对于叶肉原生质体，则需要较长的时间才能再生出新的细胞壁。

②植株再生   当原生质体形成新细胞壁后，就进入细胞分裂阶段，持续分裂的结果就形成细胞团或愈伤组织。由细胞团或愈伤组织再生成完整植株可以通过两条途径来完成，一是愈伤组织诱导形态发生；另一途径是由植株原生质体细胞系在培养过程中直接诱导形成胚状体，并且可以继续形成极性，即下端生根、上端分化芽，从而发育成完整植株。

当原生质体再生的愈伤组织长到1-5mm时，可以转接到分化培养基上。分化培养基与原生质体培养基的区别在于：不加渗透压稳定剂，只加蔗糖做碳源；提高细胞分裂素的浓度，降低生长素浓度。在分化培养基产生的苗一般没有根，需转接到生根培养基中以促进根的形成。

原生质体融合是指两种异源原生质体，在一定的条件下相互接触，发生膜融合、细胞质融合和核融合并形成杂种细胞，进一步发育成杂种植株的过程，也称体细胞杂交。原生质体融合不仅可以克服植物种属以上的有性杂交不亲和性障碍，进行遗传改良，同时也为细胞生物学和遗传学研究提供了一个新途径。

原生质体的融合方式有自发融合和诱导融合两类。自发融合是种内融合，融合率不高，融合的个体一般不能进一步发育。诱导融合是指加入诱导剂或用其他方法使二亲本原生质体融合，它可以是种内的，也可以是种间，甚至属间或科间以上的。人工诱导融合的方法有化学融合法和物理融合法两种。

①化学融合法    主要是用各种化学试剂作为诱导剂，常用的方法有高钙高PH法，聚乙二醇（PEG）法。

a、高钙高PH法。这是比较早采用的融合方法，它是以较高浓度的Ca²⁺作为融合剂，诱导原生质体融合。用PH为10.5、Ca²⁺浓度为50mmol/L的溶液，在37℃的条件下诱导两个烟草品系叶肉原生质体的融合，获得了种间杂种细胞。

b、PEG法。1974年高国楠和Michayluk用PEG诱导融合植物细胞，使原生质体融合的频率明显提高。以后又将PEG诱导与高钙高PH溶液相结合，可以显著地提高融合率，有的可高达30%~40%。具体方法是：首先制备两个不同来源的植物原生质体，按要求的比例1：1到1：4在含渗透稳定剂和钙盐的溶液内相混合，然后加入23%~30%PEG，促使原生质体迅速广泛凝聚，形成团块。然后开始洗涤，先加入碱性高钙溶液，接着用培养基洗涤PEG。当PEG被稀释和被洗涤除去时，发生了融合，而融合产物和原生质体又恢复成球形，转移到培养基中培养即可。

②物理融合法  主要包括显微镜操作、离心或振动、电刺激等来促进原生质体融合。

如微电极法诱导融合是通过插入微电极接通一定的交变电场，原生质体极化后在电场中顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，使原生质体膜被击穿而发生融合。此法基本解决了化学诱导融合剂的毒性问题，具有融合效率高，重复性好，方法简单，对原生质体伤害小等特点。

双亲原生质体融合时，可分为自体融合和异体融合两大类。自体融合的结果得到同核体，由不同双亲、原生质体融合得到异核体。与同核体相比，融合后的异核体在人工培养基上分裂分化并不占优势。通常由于启动分裂和持续分裂缓慢，而受到同核体的抑制，不能发育成为杂种植株。所以必须建立或设计出一套方法，优先选择细胞杂种植株。目前，细胞杂种选择方法主要有互补选择法、机械分离杂种细胞法和双荧光标记选择法。

①互补选择法

a、白化互补选择法。该法利用一个叶绿素缺失突变体进行筛选。Cocking（1972）利用白化矮牵牛在限定培养基上细胞分裂、分化成植株，正常矮牵牛在此限定培养基上细胞不能分裂，融合后形成的杂种细胞，在限定培养基上可以通过细胞分裂和分化进行选择。Melchers(1974)将两种突变白化苗的细胞经融合互补后产生绿苗选择到曼佗罗、矮牵牛、烟草等的种间体细胞杂种。此法可以依赖有性杂交知识，可广泛用于不同亲缘关系的融合。

b、营养缺陷型互补选择法。借助于营养缺陷突变型进行体细胞杂种的互补选择。有人用烟草抗氯酸盐突变型和不能利用硝酸盐（缺乏硝酸还原酶）的突变型，将两个不同突变型的原生质体融合起来，并把其培养在仅以硝酸盐作氮源的培养基上，选出了大量杂种体细胞。此法简单而准确，但不易找到合适的缺陷型亲本。

c、抗性互补选择法。利用原生质体对药物的不同抗性也用于互补选择杂种。例如，爬山虎的原生质体在MS培养基上一般不会超过50个细胞就停止生长，而矮牵牛的原生质体却能在MS培养基上正常分裂分化。但二者对放线菌素的反应又不同，矮牵牛细胞在10μg/L放线菌素D即敏感，爬山虎对其抗性较强。于是在含有10μg/L放线菌素D的MS培养基中，双方亲本都被抑制生长，而只有杂种细胞能够进行正常的分裂分化。

②机械分离杂种细胞法    该法就是通过显微镜操作的手段直接取出异核体。常用的是含有叶绿体其他色素质体的组织细胞，另一方则选用悬浮培养的或固体培养的细胞，不含其他色素。在异源原生质体融合后能明显识别。融合一旦发生便马上可检出其融合产物。具体方法是利用两种原生质体形态色泽上的差异，在融合处理后分别接在带有小格的“Cu-park”培养皿中，每个小格中约有2-3个原生质体。在显微镜下可以找出异源融合体，标志位置长大后转移到培养皿中培养，测定染色体的变化，比较同工酶的差异等。此法对原生质不要求特殊遗传背景，得出的结果可信度最大。但在技术操作上难度最大。

③双荧光标记选择法   Patnik和Coking等1982年在进行原生质体融合时，亲本一方是悬浮细胞来的原生质，因其没有叶绿体，有异硫氰酸荧光素（FITC）标记时会发出“苹果绿”荧光；另一亲本是含有叶率体的叶肉细胞，会发红光。二者形成的异核体（杂种细胞）在荧光显微镜下会同时发出苹果绿荧光和红光荧光，因此可方便地把杂种细胞分拣出来，加以培养。

（3）杂种植株的鉴定

①形态学鉴定   这种方法是鉴定杂种的最准确的方法。因为要在形态上表现出杂种性来，就必须有内部的大量基因的协调活动，而且基因的活动必须和细胞的活动取得了协调。但经愈伤组织途径再生植株与原生质融合产生的变异很难区别，因此仅以来形态特征来判断不太可靠，尚需配合其他方法。

②细胞学观察   应用染色体计数方法、核型分析和显带技术以亲本为对照，对杂种细胞的染色体数目、大小与形态的变化等进行观察比较。此法优于形态学鉴定，对亲源关系远的杂种细胞的判断准确性较好。

③同工酶分析  一般以双方亲本的同工酶谱带作为对照，杂种细胞都具有双亲谱带的总和。有时还出现新的谱带，则说明融合产物是异源性的。应用于分析的同工酶很多，已成功使用的有过氧化物酶、乳酸脱氢酶、脂酶、氨肽酶等。由于植物在不同的发育阶段，在不同的组织中，同工酶谱带本身可以有较大的差异，因此进行这方面的比较时，应注意取样的部位和时间要严格一致。

④分子标记鉴定   分子生物学技术的进展对于分析体细胞杂种的遗传构成有重大的促进作用。采用核酸分子杂交、限制性内切酶长度多态性（RFLP）和随机扩增多态性DNA（RAPD）分析，将使鉴定结果更精确。