结核杆菌的培养基的配制及其计数

结核杆菌培养采用罗－琴培养基，为防止培养基干裂，可加入适量甘油，在1600ml的培养基中加入甘油12ml。

罗－琴培养基成分：
磷酸二氢钾2.4g；一水硫酸镁0.24g；拘掾酸镁0.6g；天门冬素3.6g；2％孔雀绿水溶液20ml；蒸馏水600ml；马铃薯淀粉30g；甘油12ml；新鲜鸡蛋液1000ml。

具体配制方法如下：
1、加热上述重量的溶解磷酸盐，硫酸镁，拘掾酸镁，天门冬素和甘油于600ml蒸馏水中。
2、一边搅拌一边加入马铃薯淀粉，于沸水中水溶1小时，在置于56度水浴箱内1小时。
3、将新鲜鸡蛋洗净后，在75％乙醇中消毒30分钟，去除后点火烧掉鸡蛋外壳上的乙醇，无菌打破蛋壳，将蛋白和蛋黄收集于灭菌容器内，充分搅拌，无菌纱布过滤，在收集新鲜鸡蛋液1000ml；加入上述混合液中。
4、加入灭菌的2％孔雀绿水溶液，均匀混合，分装于灭菌的试管内，加塞封闭，斜置于血清凝固器内，85度1小时间歇灭菌2次。于冰箱保存备用。

结合杆菌的计数

结核菌生长缓慢且难于培养，不适于用平板培养，一是易污染环境，二是培养时间长了，平板会很快干掉。因此结核菌的cfu测定不能象大肠菌那样采用平板菌落计数法。一般很少有人做结核菌的cfu计数，如果一定要做，可用Middlebrook7H9液体培养基依次稀释，再接种于罗氏斜面培养基或Middlebrook7H10，计数可见到单菌落的培养斜面上的菌落数，计算出cfu。

一般斜面面积可达4~5平方厘米，只要稀释菌液中的活菌数足够少，就肯定可得到可目测出的单菌落数（n）。假设每个稀释度菌液的体积为v1，接种体积为V2，则cfu/ml=n×V1×稀释倍数/V2.

已培养出的结核菌菌落，可用一玻璃试管，加几颗玻璃珠，1ml生理盐水，一起高压蒸汽灭菌。然后，挑取菌落到此试管中，振摇以获得均匀菌悬液，再稀释成所需麦氏浊度。还可将已分纯的细菌接种到7H9肉汤培养基培养，待菌生长后再根据你的需要稀释成一定麦氏浊度的菌液。因Middlebrook 7H9 brooth添加了OADC及吐温-80，不但营养丰富，而且细菌可呈均匀生长。

结核菌与一般细菌不一样，容易形成菌团，接种前应研磨均匀，制备1mg/ml菌悬液后用10倍稀释，如果没经验，多接几个稀释度，每个稀释度最少3支，每支接种0.1ml，计算最后长满的不计算,可计数稀释度菌落就可以，一般合格培养基培养每毫克结核杆菌约1-2千万活菌。

如果第1次做，可以拿卡介苗(0.5mg/支)当对照（2-10百万cfu/mg），以确定实验方法无误。

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