植物细胞培养

植物细胞培养是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞或小细胞团进行培养，形成单细胞无性系或再生植株，或生产代谢产物的技术。它不仅揭示了高等植物细胞方面的重大理论问题，而且在实践上已被广泛地应用到一些研究和生产领域。

单细胞培养就是对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直至长成完整植株的技术。

在细胞培养中，即可从植物器官、组织中分离单细胞，也可以从愈伤组织中分离单细胞。常用的分离方法有：

①机械法    叶组织是分离单细胞的最好材料，在研磨中放入10g叶片和40ml研磨介质(20μmol蔗糖+10μmolMgCl2+20μmol Tris-HCl缓冲液)轻轻研磨之后，将匀浆用双层细纱布过滤，滤液经过低速离心，游离细胞就会沉降到试管底部，得到纯化细胞。

②酶解法    利用果胶酶、纤维素酶处理，分离出具有代谢活性的细胞，这种方法不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。所以用酶解法分离细胞时，必须对细胞给予渗透压保护。

③由愈伤组织分离单细胞    将未分化、易碎散的愈伤组织转移到装有适当液体培养基的三角瓶中，然后将三角瓶置于水平摇床以80~100r/min振荡培养，获得悬浮细胞液。用孔径200μm的细胞筛过滤，除去大块细胞团，再以4000r/min速度离心，除去比单细胞小的残渣碎片，获得纯净的单细胞悬浮液。

单细胞的培养方法有看护培养、平板培养的微室培养等。

①看护培养法    用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。此法简单易行，易于成功，但不能在显微镜下直接观察细胞生长过程。

其培养方法是：把含琼脂的培养液加到小三角瓶中，使成1cm厚，高压灭菌后备用。在无菌条件下，取处于活跃生长期的约1cm²大小的愈伤组织块，安放在三角瓶中固体培养基上的中央部位，并在愈伤组织块上放一片约1cm²的无菌滤纸片，将其在培养室中放置过夜，使滤纸充分吸收从组织块渗出来的营养成分。然后将分离出的单个细胞接种到滤纸上面进行培养。培养基和愈伤组织供给单细胞营养使细胞能持续分裂形成细胞团。一般1个多月后，单细胞可分裂成为肉眼可见的愈伤组织小块，待2~3个月后即可从滤纸上直接转移到新鲜培养基上，得到单细胞无性系。

②平板培养法    把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层（1mm）在培养皿底上的培养方法。该方法是选择优良单细胞株的常用方法，显微镜下可对细胞分裂增殖进行全程追踪观察。

其培养方法是先从细胞悬浮物中分离单细胞，并将悬浮液中细胞的密度调整到10³~10⁵个/ml，然后和琼脂培养基按一定的比例混合均匀（40℃），将含有细胞的培养基倒在培养皿中制成平板，用胶带封口，在25℃的条件下培养，定期观察。大约3周后即形成单细胞无性系。

平板培养的效果一般用植板率衡量。植板率是指已形成细胞团的单细胞与接种总细胞数的百分比。

植板率=（每个平板中所形成的细胞团数/每个平板中接种的细胞数）Χ100%

③微室培养法    人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。该方法可在暗视野（或相差0显微镜下清楚地观察到活细胞的各种变化，甚至还可以观察到线粒体的变化。由于培养基少，营养、水分和PH变动大，培养细胞仅能短期分裂。其培养方法是：

a、将洗净的盖玻片与载玻片在酒精灯火焰上消毒，冷却后按盖玻片大小在载玻片上涂一圈四环素眼膏。

b、将细胞悬浮液滴一小滴在载玻片上，然后在四环素眼膏上放一小段毛细管，将消毒后的盖玻片盖在四环素眼膏的框子沙锅内，使其与眼膏紧密接触，在盖玻片与载玻片之间造成一密闭的小室，这小室通过一段毛细管与外界通气，盖玻片盖上后要使它与细胞悬浮液滴相接触。

c、带有培养物的微室可以按需要放在培养箱或培养室中，温度26~28℃，光照或黑暗的条件下进行培养。

d、观察或照相时一定要在同一温度下进行。

（3）影响单细胞培养的主要因素

①培养基成分   除去培养基的基本成分外，采用生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基培养单细胞有时会收到良好的效果。在单细胞培养中，补充生长调节剂是非常重要的，它可以大大提高植板效率。适当调整培养基的PH也能提高植板率。

②细胞密度   单细胞培养要求植板的细胞有一个标准的临界密度才能促进其分裂和发育，低于此临界密度，培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团。植板的密度不是一成不变的，它因培养基的营养状况而改变，即培养基的成分越复杂，营养成分越丰富，那么植板细胞的临界度越低；反之，植板密度要求越高，一般要求至少10³个/ml以上。此外，植板率高低也与细胞活力等因素有关。

 

细胞悬浮培养是将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行培养的一种方式。它是从愈伤组织液体培养技术基础上发展起来的一种新的培养技术。这些细胞和小细胞团可来源于愈伤组织，也可来自幼嫩植株、花粉或其他组织、器官。悬浮培养能大量提供较为均匀一致的植物细胞，并且细胞增殖速度比愈伤组织快，适合进行大规模的细胞培养，因此在植物产品工业化生产上有巨大的应用潜力。

细胞悬浮培养首先要筛选和鉴定培养的单个细胞，从中挑选出生长快，有效成分高，且适合悬浮培养的细胞株，然后进行逐步扩大培养，最后应用于工业化生产。细胞悬浮培养方法主要有分批培养法、半连续培养法和连续培养法3种。

①分批培养    将植物细胞分散在一定容积的培养基系统中进行培养的方法。在培养过程中除空气和挥发性代谢物可以向外输送进行完全交换外，其余都是在一个封闭系统中进行的。培养基中基质浓度随培养时间增加而下降，细胞浓度和产物浓度则随培养时间的增加而增加。

分批培养的特点是细胞生长在固定体积的培养基汇总，当培养基中的养分耗尽时，细胞的分裂和生长就停止了。在整个培养过程中，细胞数的变化呈S形曲线。初期细胞很少分裂，细胞数增加不多，增长缓慢，称延迟期；中期生长最快，细胞数目迅速增加，增长速率保持不变，称对数增长期；随后由于养分供应差和代谢物积累，环境恶化，细胞分裂生长减慢称减慢期；最后养分基本耗尽，有害代谢物积累，导致细胞分裂停止，直至死亡，称静止期。

②半连续培养法   该法是在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法。反应过程通常在一定时间间隔进行数次反复操作以达到培养细胞和生产有用物质的目的。此法可不断补充培养液中的营养成分，减少接种次数，培养细胞所处的环境与分批培养法一样，随时间而变化。工业生产中为简化操作过程，确保细胞增殖量，常采用半连续培养法。

③连续培养法   该法是在培养过程中，不断抽取悬浮培养物并注入新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，并保持其恒定体积的培养方法。连续培养的特点是培养过程中不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，培养期间不会发生 营养不足的现象，使细胞保持在对数生长期，细胞增殖速度快，适用于大规模工业化生产。可分为两种培养类型：

a、封闭式连续培养。排出的旧培养液由新鲜培养液补充，进入的和排出的培养液体积相等。并把排出细胞收集，重新放入培养系统继续培养，所以培养系统中的细胞数目不断增加。

b、开放式连续培养。在连续培养期间，新鲜培养液的注入速度等于旧培养液的排出速度，细胞也随悬浮液一起排出，不再收集流出的细胞。流出的细胞数相当于培养系统中新细胞的增加数，因此，培养系统中的细胞密度保持恒定。

① 培养基    培养基成分对细胞培养的生物量和有用物质含量的提高都有密切关系，要互相协调。最主要是要根据不同种类的培养细胞选择适当的碳源、氮源。培养基PH为5~6较为适宜。

细胞培养中生长调节物质的数量和种类对次生物质的合成起着重要作用。生长素和细胞分裂素不仅保持细胞分裂的作用，而且不同类别的生长素对次生代谢产物合成有着不同的影响。如加入2，4-D，往往阻止多种植物细胞培养时有用物质的产生，但它却能显著提高人参皂甙的产量。

②培养条件   光照时间、光质和光强对培养细胞的生长和有用的物质的生产均有大影响。如芸香愈伤组织在光照下培养，其芳香化合物的含量比暗培养下增加1.5~3.6倍。但光也能抑制某些化合物产生，如蓝光和白光能使紫草素合成受阻，萜烯类合成也能被蓝光和强白光抑制。

温度对细胞的生长和有用物质的合成与积累均有一定的影响，细胞培养时一般采用25℃左右的温度。培养物能与氧气接触，有利于细胞的代谢和次生物质的合成。