不同方法对明串珠菌及其他细菌的抑制效果

 （*古巴甘蔗副产物研究所（ICIDCA），**阿根廷Obispo Colombres农工实验站，***墨西哥Morelos生物技术研究所，****美国BrighamYoung大学）

 摘 要

     在从压榨间直到蔗汁澄清的蔗糖生产过程中，蔗汁中微生物活动是破坏蔗糖品质的一个重要因素。蔗糖损失和葡聚糖的形成通常与蔗汁中微生物引起的变质有关。多年来，这一直成为糖厂试图改善蔗糖品质时所面临的问题。本文以直接影响得糖量的微生物减少和相对纯度为指标，研究了不同杀菌方法在蔗汁中的效果。浓度为0.007%的S抑制剂显示了对某糖厂初压汁和混合汁中的微生物菌群的抗菌效应。在对照组中，12h后观察到4.8单位的纯度降低。加入S抑制剂后，只降低2个单位。且蔗汁的稳定性在3个样品中几乎完全一致。以S抑制剂处理的蔗汁保持深褐色和清新的气味，且pH与初始相比无显著变化，而未处理的蔗汁变浅褐色，产生很强的酒味，pH和纯度显著降低。这种稳定效应尚未被其他常用的糖用杀菌剂所报导。同样，本文证明了有可能通过使用S抑制剂来稳定混合汁。经S抑制剂处理后，游离的还原物质和多聚糖比不经处理的样品低6倍。这些结果表明，形成的葡聚糖以及随之形成的游离果糖减少。

 引 言

       蔗糖损失和葡聚糖的形成通常与蔗汁变质相联系。用变质蔗汁生产的蔗糖具有高含量的葡聚糖，从而并不符合某些以蔗糖为原料精制为商品的接受标准。多年来，这已成为糖厂试图改善蔗糖品质所面临的问题。

         肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）合成葡聚糖蔗糖酶（蔗糖-6-葡糖基转移酶），该酶聚合蔗糖为葡聚糖。已证明该微生物可从缝隙侵入收获前用于储备蔗汁的组织（Demole等，1962）。

         蔗汁的物化特性使其成为微生物生长的优良环境。微生物的代谢特性使其可降解蔗汁中的蔗糖并形成代谢物如乳酸，乙酸，乙醇，甘露醇等，以及多聚糖如葡聚糖和果聚糖（Michelena等，1992）。

这一现象的影响范围在压榨区变得显著。因高发生率细菌性降解的影响，从初压汁到混合汁过程中，纯度降低了两个单位。

         先以热水、蒸汽完全清洗榨汁区并随后用杀菌剂处理是防止甘蔗和蔗汁降解的常用措施。

         目前，多种化学物质被用于杀菌剂并被考虑作为糖厂的清洁剂，如卤素，有机硫化物，四铵化物均被采用（Cerutti等，2002），然而，几乎没有源于生物的（biological origin）杀菌剂在糖业中进行试验。

         本研究目的是以直接影响得糖率的微生物减少和相对纯度为指标，确定蔗汁中不同杀菌方法的效果。

材料与方法

a）实验室规模下不同方法抑制肠膜明串珠菌的效果

菌株

         用于本研究的冻干菌株肠膜明串珠菌亚种明串珠菌3A，1K，2L，TB来源于阿根廷EEAOC标本收藏所；B/110-1-1，B/110-1-2和B/110-1-3来源于古巴ICIDCA标本收藏所。这些微生物曾在甘蔗收获季节（阿根廷为5～10月，古巴为1～5月）从甘蔗和蔗汁中分离鉴定。

         可可球二孢菌（Botryodiplodia theobromae）715和假单胞菌PSS被用于产生具有抗菌特性的代谢物。

         被命名为S的抑制剂由茉莉酸（jasmonic acid，JA）的铜盐与其他防腐剂结合而构成。

抗生代谢物的制备

         茉莉酸（JA）从以蔗糖为碳源，KNO₃为氮源的Miersch培养基（5）上的可可球二胞菌培养物中获得。接种10个8mm的菌丝体片断后（菌丝体从培替氏培养皿中接种到含有1000ml Miersh培养基的5000ml的锥形摇瓶中培养而得），在30℃下培养15天。用Whatman N⁰ 4滤纸过滤分离发酵培养液与菌丝体。用4M的Hcl将5ml培养液pH调至3.0，随后用乙酸乙酯（1:1）萃取茉莉酸。含有茉莉酸的抽提物用无水硫酸钠脱水，50℃旋转蒸发（rotoevaporation）干燥。用气相色谱确定茉莉酸及相关化合物。（3）

         假单胞菌PSS于含有谷氨酸和盐的培养基中30℃培养。生物量经离心分离，通风干燥。

固体培养基的方法

         为确定代谢物的抗菌效果，采用了一种琼脂扩散方法（agar diffusion technique）（4）。抗菌活性的探测由细菌营养琼脂的琼脂扩散方法所确定。

         方法：用22μm Millipore®微孔滤膜将茉莉酸过滤除菌。气相色谱分析确定茉莉酸浓度为246mg/L。在确定抗菌能力的培养方法规定的20ml生物肉汤培养物中分别加入2，10，15，30，60，100和200ppm的茉莉酸。

         抑菌的定性分析采用含200ppm茉莉酸的样品。

         培养物（对照和加入茉莉酸）加入5.5×1.5cm皮氏培养皿并做3份平行。

液体培养基的方法

         含有20g/L蔗糖，6g/L酵母膏，5g/L Na₂HPO₄以及盐类的生长培养基被用于研究对明串珠菌生长和产生葡聚糖的抑制效果。生长情况通过540nm的光吸收测定。糖耗通过HPLC测定，葡聚糖浓度通过苯酚-硫酸法测定（5）。

S抑制剂对糖厂蔗汁的抑菌效果

         在本实验中，10升的茉莉酸铜盐，以1:1与水稀释并应用于第一座和第六座榨机，30分钟后重复处理一次。

         榨汁间处理量为260T/h，因此允许S抑制剂的加入剂量约为0.007%。分别在加入之前，加入时和加入5min后，第二次加入5min后，第二次加入30min后收集样品。进行微生物计数（酵母，细菌和明串珠菌）。测定pH，转光度和纯度以确定蔗汁的稳定性（Panreac，1992）。

         接触时间定义为混合汁能保持到澄清工序的热处理之前。这一指标根据每个糖厂的工况而有所不同。在本研究中，研究了1，5和30分钟的接触时间。

         活细胞数量（CFU/ml），通过用选择性培养基确定，以确定在研究全部微生物（营养琼脂），多聚糖产生细菌（酵母膏-葡萄糖琼脂）和真菌（麦芽琼脂）时每种产品的抗菌效果。样品于37℃时接种并于30℃培养48h。实验做3份平行（抑制的百分比定义为%抑制=（初始CFU/ml – 最终CFU/ml）/初始CFU/ml ×100）。

结果与讨论

a）肠膜明串珠菌在实验室规模的抑制效果

         含有不同浓度茉莉酸的可可球二孢菌715上清液产生的对肠膜明串珠菌抑制效果的研究

         研究表明含有高达600mg/L的球胞二菌715上清液在24至72小时后抑制肠膜明串珠菌L1101-1,1-2和1-3，48h后出现最大的抑制区（13mm）。

         尽管最大的抑制区出现在使用400mg/L茉莉酸处理之后，此浓度的抑制效果与使用100ml/L茉莉酸处理的效果并无显著差异。

          中试规模的30℃下Glutid（一种从铜绿假单胞菌代谢物中分离而得的杀真菌剂——译者注），臭氧和S抑制剂对明串珠菌的作用。固体形式的Gluitid在两种不同浓度下相对于对照样更有利于微生物生长。这可归结于硫酸铵维持Gluticid代谢，有报导该效应有利于明串珠菌的代谢。另一方面，臭氧和S抑制剂通过使明串珠菌降低了超过两个对数的计数单位而显示了显著的杀菌特性，在0.2%浓度的S抑制剂观察到最大抑制效果。同样地，蔗汁中真菌细胞（酵母）3个对数的降低表明了杀真菌（fungcidal）特性。在本实验条件下，在30℃时（古巴甘蔗收获季节的常温）0.2%浓度的S抑制剂具有显著的抗菌效果。

          根据中试结果，我们期望在榨汁中应用该产品进行研究，以确定该产品作为较易用于降低对初始工艺和最终产品有害的微生物的数量的压榨杀菌剂的有效性。考虑到0.2%浓度的S抑制剂不切实际，不太可能应用于压榨间，即杀菌剂费用不应高于因微生物降解而损失的蔗糖价值，故测试了0.007%浓度的S抑制剂。测试了在初压汁和混合汁中降低的浓度对微生物量，产多聚糖细菌（主要是明串珠菌和杆菌）以及酵母的效果。其结果参见表I。

 表I 0.007%浓度的S抑制剂对压榨间初压汁和混合汁的微生物群落的抗菌效果

         在本研究中，接触时间定为不超过30min。所得的数据使我们可以推断0.007%浓度的S抑制剂和30min的接触时间足以对所有被研究的微生物产生大于90%的抑制：对总微生物量为99.6%，对多聚糖产生菌大于96%，对酵母大于94%。

         结果表明甚至在接触1min后，S抑制剂能立即发挥抗微生物效应（通过这3种微生物的急剧下降和高度的抑制显示出来）。

添加S抑制剂对澄清汁纯度的影响

       使用两种浓度的S抑制剂来研究对蔗汁纯度的稳定效果。在对照样中（表II），纯度在12h后降低了4.8个单位。加入S抑制剂产生了较少的纯度降低（2个单位）。此外，在样品3中观察到几乎完全稳定了蔗汁。经S抑制剂处理的蔗汁保持深褐色和清新气味，且pH相对初始时无明显降低。另一方面，未经处理的蔗汁变浅褐色，具有强烈的酒味，并且pH和纯度显著降低。这种稳定效应尚未在其他常用的糖用杀菌剂中报导（技术报告，1982）。

表II 添加S抑制剂对澄清汁纯度的影响

S抑制剂加入后对混合汁的稳定情况

 表III是以0.005%的S抑制剂处理混合汁的结果。

表III 加入0.005％的S抑制剂对混合蔗汁的稳定效果

       结果显示，经过S抑制剂处理后，游离的还原糖和多聚糖比未经处理的样品低6倍。表明葡聚糖以及随之形成的游离果糖的减少。这一结果可减少在收砍后甘蔗或加工中断时因形成多聚糖而造成的蔗糖损失，从而具有重要的经济意义。

结论

(1) 从可可球二孢菌得到的上清液可抑制肠膜明串珠菌。同样的效果在以臭氧和S抑制剂处理后被观察到。经S抑制剂处理后观察到最大的抑制效果。

(2) 0.007%浓度的S抑制剂和30min的接触时间足以对所有被研究的微生物产生大于90％的抑制效果：对总微生物量为99.6%，对多聚糖产生菌大于96%，对酵母大于94%。

(3) 除具有抗菌特性之外，S抑制剂可稳定蔗汁中的蔗糖分。这种稳定效应尚未在其他常用的杀菌剂中报导。

原文参考文献6篇(略）

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