红曲米中七株红曲霉纯培养的分离鉴定

关键词：红曲米；红曲霉；分纯；鉴定 

中图分类号：TS201.3                        文献标识码：A

自1884 年Van Tieghen 首次分离出红曲霉，至今已有百年的历史。近几年红曲霉的许多功效相继被证实后，红曲菌的相关专利陆续出现。自1975年至1997年为止各国关于红曲霉的专利将近200 篇^[1]。目前红曲色素应用是红曲研究的主要方向，近20年有近40%的专利都在此领域。1979 年红曲霉被发现可产生胆固醇合成抑制剂，红曲霉降血糖、血压及胆固醇功效即成为众人关注的焦点 ^[2]。

另外作为食品添加剂也是红曲应用的主要方向，有关添加红曲成为功能性食品的专利有31篇，且多在日本申请。还有用于生产各种酶的专利15篇，以及在化妆品、处理废水、饲料上的应用^[3]。对红曲霉的研究已从红曲色素扩展到有关降血压、血糖及胆固醇，红曲霉抗菌作用等多个方面。

本论文报道了对广西所产红曲米中红曲霉的分离纯化工作。对广西武宣一带的红曲米中的红曲霉进行分纯，得到了7个纯培养，进行了属的鉴定。发现其中一株有较为突出的抗菌能力（另文发表）；还有一株有较为突出的产红曲色素能力。研究成果扩大了红曲霉的菌种库，为发掘红曲霉生物资源做了有益工作。

1  实验材料

1.1  红曲米：取自广西武宣地区，是居民制作红糟酸所用的发酵剂。

1.2  培养基：富集活化液：12⁰Bx米曲汁900mL，乳酸7mL，无水乙醇100mL，于121℃灭菌20min，使用时以无菌操作加入30ppm链霉素。分纯培养基: 12⁰Bx米曲汁900mL，6％NaCl，2％琼脂，121℃灭菌30min。

2  研究方法

2.1  红曲霉的分纯与鉴定：取红曲米25粒放入100mL富集活化液中，30℃培养５天。采用

米曲琼脂汁培养基，对数稀释倾注法分纯。以无菌操作将生长迅速、健壮的菌落，挑取放到

富集活化液中继续富集活化，待培养5天后重复上述分纯操作，经过多次操作就可以分离得

到红曲霉纯培养。

    通过菌落形态、菌丝体形态观察，耐酒精、耐NaCl实验，进行红曲霉纯培养的鉴定。

2.2  红曲霉产红曲色素的研究：用米曲汁培养基，遮光，32℃，160r/min 培养六天。用分光光度法测定总色价。

3  实验结果

3.1  红曲霉的富集活化

活化培养的第二天，红曲米开始有附着的白色菌丝；第三天红曲米上浮，米身附着大量菌丝；第四天红曲米全部上浮，菌丝开始粘连；五天以后出现白色菌膜；七八天后白色菌膜转变为红色。根据菌体质量测定，红曲霉生长对数期大约处于第五、第六天，最适合用作接种材料。

3.2  红曲霉的分离鉴定：

3.2.1  菌落形态特征。红曲霉培养初期都为白色小菌落，经过培养后，菌落开始老熟，表面的颜色变化比较丰富，有的菌落颜色开始改变，逐渐变成橙色、浅蓝色、灰色、铅灰色和灰白色等；菌落的主要形状为皮膜状和绒毯状，大多菌落有放射状的沟纹，边沿一般比较整齐。得到7个纯培养，菌落特征见表1。

表1　 7株红曲霉纯培养的菌落形态

菌株   菌落大小   正面形态      皱折      颜色    侧面观     背面颜色     

编号    (mm)                                  

M-1     38       圆形绒垫状    辐射状     红色      凸起      深红色

M-2     20       圆形皮膜状    有皱折     白色     不凸起      红色      

M-3     38       圆形绒垫状    辐射状     橙色      凸起       橙色

M-4     40       圆形皮膜状    辐射状     白绿灰^①不明显      橙色

M-5     29       圆形皮膜状    不明显     白铅绿^②  不凸起      橙色

M-6     20       圆形皮膜状    不明显     白绿^③    不凸起      橙色

M-7     42       圆形绒垫状    不明显     白色     不凸起      橙色

注:①菌落从里至外为三个色环，颜色依次为灰色、绿色和白色；②菌落从里至外为两个色环，颜色依次为灰色和白色；③菌落从里至外为两个色环，颜色依次为绿色和白色。

3.2.2  个体形态特征。30℃培养3天的红曲霉纯培养，用手术刀切取大小约1×1ｍｍ的菌苔，制成水浸片，镜检观察个体形态，7个菌株均观察到细胞横隔，有足细胞，梨形的分生孢子，有的还观察到闭囊壳结构．

3.2.3  曲霉纯培养的分类

根据以上形态观察结果，将７株纯培养鉴定为红曲霉属^[4]。

根据1992年ATCC真菌目录，红曲霉菌主要可分为三大类。按照文献的检索方法对所得的7个菌株进行测定后，分类结果见表2。

表2  ７株红曲霉纯培养的分类结果

类别          MEA上菌落直径（mm）       色素颗粒        菌株编号

 M.purpureur         < 28mm                 有             M-2 M-6 M-1

M.pilosus           > 28mm                 有             M-3 M-7

M.ruber             > 28mm                 无             M-5 M-4

M-1、M-2、M-6属于紫色红曲霉类(M.purpureus)，M-4、M-5属于红色红曲霉类(M.ruber)，M-3、M-7属于丛毛状红曲霉类(M.pilosus)。 

3.3  M-1的红曲色素产生能力

分纯过程中发现M-1菌株的菌落及其培养液显示出突出的红色。我们对其进行了种的鉴定和红曲色素产生能力的测定。

          3.3.1  根据PDA平板上30℃培养7天的结果和耐乙醇、NaCl特征可以对M-1菌株进一步分类，结果如表3所示。

表3  M-1菌株的分类特征

菌株      形成      菌落      分生孢子     产色素     耐30％     耐6％

代号     闭囊壳     形状       链形状                  乙醇       NaCl

M-1       否       溶岩状      螺旋        产生      不耐        不耐

根据检索表^[5]，将M-1菌株鉴定为M.purpureus Wen紫色红曲菌。

3.2.2  M-1、M-2、M-3、M-4产红曲色素的能力

米曲汁培养基，32℃，160r/min遮光培养六天。用分光光度法测定总色价。结果见表4。

表4  M-1，M-2 ，M-3， M-4菌株产色素能力对比

菌株        Ｍ－１          Ｍ－２           Ｍ－３         Ｍ－４

第一次      146.6           89.8             62.1            62.5

第二次      143.3           83.8             57.3            59.2

第三次      142.6           81.3             60.8            57.1

平均       144.2           85.0             60.1            59.6

可见M-１菌株产红曲色素能力十分突出，发酵液总色价为144.2μ/mL。

4  结论

4.1  从广西武宣红曲米中获得了7 个红曲霉纯培养。M-2、M-6、M-1属于紫色红曲霉类(M.purpureus)，M-5、M-4属于红色红曲霉类(M.ruber)，M-3、M-7属于丛毛状红曲霉类(M.pilosus)。

4.2  成功筛选到一株发酵液总色价为144.2μ/ml的红曲霉菌株M-1。经形态观察和耐酒精、耐NaCl能力实验鉴定为紫色红曲霉（M.purpureus Wen）。说明广西武宣地区的红曲米中的红曲霉在产生红曲色素方面具有较高的研究潜力。

4.3  关于M-1号菌株所产色素的成分、性质还有待进一步研究和探讨。以M-1作为出发菌株，通过诱变育种和基因工程，开发红曲色素生产菌株具有研究价值。

参考文献

[1] 陈彦霖,李昭蓉,陈建州等.红曲菌种的研究开发与应用[J].食品工业月刊(台),1998,30.

[2] 路秀玲,赵树欣,宫慧梅.红曲霉的应用研究现状与展望[J].食品科技,2001,(1):43-46.

[3] 贾波,周立平.红曲霉研究之现状及发展前景[J].中国食品添加剂,2002, (6):32-35.   

[4] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979:129-136.

[5] 戴芳澜.真菌的形态和分类[M].北京:科学出版社,1987.3.

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