1、单层细胞的裂解
a）吸出培养液，以7ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液PBS冲洗细胞培养皿内的单层细胞，重复1次，将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕。也可将平板放在一块铝板上，再将铝板置于冰盘上。
b）直径为
c）加0.5ml蛋白酶消化缓冲液，用刮棒混匀粘稠状裂解物并将其刮到平板的边缘。（蛋白酶消化缓冲液配方：0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)，25mmol/L EDTA(pH8.0)，0.3mol/L NaCl，2％ SDS）
d）用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复3－4次，剪切DNA。
e）加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，充分混匀后置于
2、悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解
a）于
b）估计细胞沉淀的体积，用10-20倍体积的RNA提取缓冲液重悬之。
c）加入与步骤b）所加RNA提取缓冲液体相同的蛋白酶消化缓冲液，用振荡器迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复3－4次，剪切DNA。
d）加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，充分混匀后置于
二、提取步骤
1、用等体积酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白质。
2、用吊桶式转头于室温以
3、于
4、每个直径为
5、分别按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫苏糖醇（DTT），然后分别按1000单位/或10mmol/L 的终深度加台盘RNA酶抑制剂或氧钒核苷复合物。
6、加入无RNA酶的胰DNA酶I至终浓度为2μg/ml，混匀，于
7、分别按10mmol/L和0.2％的终浓度加EDTA和SDS。
8、用等体积酚：氯仿抽提1次。
9、于室温以
10、用微量离心机于
11、吸出所有的乙醇，将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟，让最后残存的痕量乙醇挥发干净。
12、用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－
三、注意事项
1、测定最终所得溶液的OD260值可以确定RNA的浓度。取10μl乙醇/TE混合液离心沉淀RNA，以400水重溶，测定OD260值，OD260＝1的RNA溶液每毫升约含40μg RNA。
2、如果需要，可用oligo(dT)－纤维素层析法从所制备的细胞总RNA中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的mRNA或购买试剂盒进行mRNA的纯化。
3、某些情况下（例如从感染了DNA病毒或用DNA转染的细胞中制备RNA时），必须从细胞总RNA中去除寡脱氧核核苷酸。否则，当用这种RNA构建cDNA库或进行引物延伸反应时应会出问题，反转录过程中法染的模板DNA片段可能会与RNA杂交而充当引物，从而导致物定mRNA5'末端定位的错误或产生截短的cDNA克隆。
a）步骤12后，加200μl 3mol/L乙酸钠（pH5.2），用自动微量移液器反复吹吸，以重悬核酸沉淀，将悬浮液移至另一个灭菌的微量离心管内。
b）用微量离心机于室温以
c）弃上清液，用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸钠（pH5.2），分混匀，加入550μl用冰预冷的乙醇。混匀溶液，在冰上骤冷30分钟。用微量离心机于
d）弃上清液，用300μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加1ml乙醇，－
回收RNA时，只需取出1小份贮存液，加3mol乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L充分混匀，用微量离心机于
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