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食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法


录入时间:2010-10-29 11:11:53 来源:青岛海博

1 主题内容与适用范围

本文规定了食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法。

本文适用于航空食品的检验。

2 设备和材料

吸管(1ml10ml)、恒温培养箱(36±144.5±0.5)、冰箱、均质器、振荡器、平皿、稀释瓶、天平、显微镜等

3 培养基和试剂

月桂基硫酸盐胰蛋白月示(LST)肉汤、煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤、EC肉汤、伊红美蓝琼脂(EMB)、营养琼脂斜面、色氨酸肉汤、MR-PV培养基、Korser氏枸掾酸盐肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)、Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液、生理盐水、革兰氏染色液、Kovacs氏靛基质试剂、甲基红指示剂、Voges-proskauerV-P)试剂、

4 样品制备

4.1 以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装,则用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。

4.2 制备样品匀液

以无菌操作取25g样品,放入装有225ml稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1-2min,制成110的样品匀液。如样品均质时间超过2min,应在均质杯外加冰水冷却。

4.3 稀释样品匀液

10ml灭菌吸管准确吸取110的样品匀液10ml,放入装有90ml稀释剂的150ml稀释瓶中。迅速振摇,将样品混匀,制成1100的样品匀液。

5 大肠菌群的测定

5.1 大肠菌群MPN值的测定

5.1.1 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白月示(LST)肉汤,每管接种1ml

5.1.2 将接种管置于36±1的培养48±2h

5.1.3 观察试管的产气情况:检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性;如有产气者,则进一步作证实试验。

5.2 大肠菌群的证实试验

5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。

5.2.2 BGLB肉汤管于36±1的培养48±2h

5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

5.2.4 结果报告:按BGLB肉汤产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。

6 粪大肠菌群测定

6.1 用接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。

6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入44.5±0.5水浴箱内,培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5产气阳性的大肠杆菌和44.5不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。

6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性;不产气管为粪大肠菌群试验阴性。

6.4 结果报告:按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。

7 大肠杆菌测定

7.1 6.3条中的EC肉汤管继续培养24h取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1的培养24±2h

7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

7.3 如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1的培养18-24h

7.4 将斜面培养物移种到下列培养基进行生化试验。

7.4.1 色氨酸肉汤:在36±1的培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2-0.3ml,上层出现红色为靛基质阳性反应。

7.4.2 MR-VP培养基:在36±1的培养48±2h后。以无菌操作移取培养物1ml13mm*100mm试管中,加5%萘酚乙醇溶液0.6ml40%氢氧化钾溶液0.2ml和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。

MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。

7.4.3 Korser氏枸掾酸盐肉汤:于36±1的培养96h记录有无生长。

7.4.4 LST肉汤:于36±1的培养48±2h,观察试管中是否产气。

7.4.5 革兰氏染色:取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。

7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下

靛基质

MR

VP

枸橼酸

鉴定(型别)

+

+

-

-

典型大肠杆菌

-

+

-

-

非典型大肠杆菌

+

+

-

+

典型中间型

-

+

-

+

非典型中间型

-

-

+

+

典型产气肠杆菌

+

-

+

+

非典型产气肠杆菌

 如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。

7.5 结果报告:大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为++---+--,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。

注:本文参照SN0169-92《出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》

 

 

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