亚硫酸盐还原菌及检测

一、生物学特性与卫生学意义
    亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌是梭状芽胞杆菌属的一群细菌，而不是一个生物学分类单位。多指厌氧芽胞杆菌，代表性菌株是致黑梭状芽胞杆菌，其他常见的还有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌等。此类细菌的主要特征是将亚硫酸盐还原为硫化物，多为有动力的革兰氏阳性菌，可形成芽胞，厌氧生长。
    厌氧亚硫酸盐还原菌的孢子在自然环境中广泛存在，通常出现在人和动物的粪便排泄物，废水和土壤中。与大肠杆菌和其它杆菌不同的是，由于它们的孢子比营养体对物理和化学因子具有更强的抵抗力，所以可以在自然环境中存活很大时间。因而，通常将他们作为长期污染或间断污染的指示菌。它们甚至可以抵抗正常水处理所用氯的工作浓度，因此，它们对判断是否已达到控制目的非常有用。
    由于此类细菌抵抗力强，即使在经适当加工处理的加工食品中其芽胞仍会存活，条件适宜时又会生长繁殖，造成食品品质降低或腐败，甚至会引起食物中毒的危险。因此在食品的制备、贮存以及食品加工厂环境卫生控制上颇受重视，作为食品、矿泉水、加工设备卫生、生产环境的卫生状况的评估指标，正确得到越来越广泛的应用。
    该类细菌的检测多用于环境水质和生活饮用水污染状况的评估，在九十年代中后期开始在食品卫生领域中有所要求，但多局限于欧洲国家和地区，如法国、瑞士、英国、捷克等欧盟成员国。到目前为止，该菌一般不被作为食品卫生常规检测项目和致病菌检测内容，我国和美国未将该检测项目列入食品微生物检测项目和要求中。
    二、检测方法
    由于此类细菌以形成芽胞、厌氧生长和还原亚硫酸盐为硫化氢为主要特征，往往无需作进一步实验验证，因此在检测中将满足以上三个条件的一群细菌全部认定为厌氧亚硫酸盐还原菌。
    检测方法一般包括以下三部分：检样在接种前在80-100℃水浴中处理10-15分钟，以杀灭抵抗力弱的芽胞细菌的营养体，同时刺激芽胞的繁殖；通过选择性培养如亚硫酸铁盐琼脂等判定是否具有还原亚硫酸盐的能力，如果有则进一步与培养基中的亚铁盐如枸橼酸铁反应，使菌落呈现黑色；培养基接种后置于厌氧环境中培养确认厌氧特征。也可在培养基中加入抗生素等抑制剂抑制其它非亚硫酸盐还原菌的生长。
    下面详细介绍亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌的检验方法。
    1.培养基和试剂
    1.1 氯化钠胰蛋白胨稀释液
    1.2 亚硫酸铁琼脂
    1.3 过氧化氢试剂
    2.仪器和设备
    2.1 均质器:用于处理固体样品
    2.2培养罐（箱）,带产生厌氧环境的设备或试剂
    2.3 恒温培养箱:37±1℃或46±1℃
    2.4 振荡器
    2.5 吸管:1mL、10mL,具0.1mL刻度
    2.6 培养皿:直径为90mm
    2.7 稀释瓶:容量为500mL和250mL的广口瓶
    2.8 天平:感量0.1g
    3.抽样和试样制备
    3.1 抽样
    参照SN0330-94规定抽样
    3.2试样制备
    无菌操作称取剪碎后的样品25g,置于装有225mL氯化钠胰蛋白胨稀释液的广口瓶中。若检测亚硫酸盐还原梭菌的芽胞,可75℃ 20min或煮沸保持10min热处理样品,之后以流水迅速冷却至室温后再称取。充分混匀后据样品污染情况做进一步的系列十倍梯度稀释。
    4.检验步骤与计数
    4.1菌落计数法
    适用于检查未经加工处理的生鲜食品及亚硫酸盐还原梭菌计数>10g(mL)的食品。
    4.1.1接种和培养
    4.1.1.1对每一份试样，选用适宜的三个连续稀释度的样液，分别用灭菌吸管吸取1 mL，一式双份地接种于每个灭菌的培养皿中。
    4.1.1.2 倾注约15 mL制备好的并于水浴箱保温至45℃的亚硫酸铁琼脂。从制备最初稀释液结束到倾注培养基于最后一个平皿所用的时间不应超过15min。仔细将接种物和培养基充分混匀，水平放置，使其凝固。
    4.1.1.3待混合物凝固后，在倾注10 mL同样的培养基于已凝固的培养基上作为隔层以防氧吸附，并防止细菌蔓延生长。
    4.1.1.4 待该隔层凝固后反转制备好的平板，于37±1℃厌氧培养24-48h。若对培养温度有特殊要求（如46℃），可依据情况进行培养。
    4.1.2计数
    4.1.2.1亚硫酸盐还原梭菌在亚硫酸铁琼脂上呈暗灰色或黑色菌落。37±1℃厌氧培养24h后，计数典型的菌落；若平板上无特征性菌落或菌落较小（<0.5mm），则需继续培养24h再计数；若48 h后的菌落增大以至相连，则以24 h的计数为准，反之则以48h为准。
    那些仅产生氢（而不是H2S）的厌氧菌生长时也可还原亚硫酸盐而导致培养基出现弥散的、非典型的普遍变黑，这种现象不应计数。
    4.1.2.2取特征性菌落（不少于5个）移种于疱肉培养基中，37±1℃厌氧培养24-72 h。待出现生长特征（培养液浑浊、产气、出现异味）后，按5条进行证实试验。对阳性结果进行计数。
    4.1.2.3读取带有10-100个黑色菌落的平皿，结果以相应稀释度的两个平板的菌落数平均值乘以相应稀释倍数来计算每克样品中亚硫酸盐还原梭菌数。结果报告如下：估计亚硫酸盐还原梭菌数/g(mL)。
    若相应测试试样的两个平板上均无特征性菌落，以<10/g(mL)报告
    4.2最近似值（MPN）法
    适用于检查亚硫酸盐还原梭菌计数≤10 g(mL)及含有受损伤的亚硫酸盐还原梭菌的加工食品。
    4.2.1接种和培养
    4.2.1.1增菌
    选用适宜的三个连续稀释的样液，从每个样液中分别吸取1mL，一式三份地接种于3管装有疱肉培养基的试管中,接种后上面覆盖一层无菌的液体石蜡，37±1℃培养24-72h。待出现生长特征（培养液混浊、产气、出现异味）后,按5.1条进行镜检。反之，则报告阴性。
    4.2.1.2分离培养
    取4.2.1.1增菌培养物1mL置于灭菌的培养皿中，倾注约15mL45℃的亚硫酸铁琼脂。仔细将接种物和培养基充分混匀，待其凝固后，再倾注10mL同样的培养基作为隔层，于37±1℃厌氧培养24-48h。生成的暗灰色或黑色菌落，按5条加以证实；反之，则报告阴性。
    4.2.2结果计算
    4.2.2.1计数每个稀释度得到的阳性反应管数。
    4.2.2.2利用MPN表，由阳性管数估算每克（毫升）试样中亚硫酸盐还原梭菌最近似值。结果报告如下：估计亚硫酸盐还原梭菌数/g(mL)。
    5.证实试验
    5.1形态观察
    取疱肉培养物涂片，镜检，作革兰氏染色，检查培养物细菌形态。亚硫酸盐还原梭菌为革兰氏阳性杆菌，单个散在，成对、成小链状或并列地聚堆存在。产芽胞时，芽胞呈卵圆形或球形，位于中央、次终端或终端。
    5.2过氧化氢酶试验
    在洁净载玻片上滴1滴培养物，再滴加1-2 滴3% 的过氧化氢。
    出现小气泡说明有过氧化氢酶活性。
    亚硫酸盐还原梭菌不形成过氧化氢酶。
    附录：
    A1 氯化钠胰蛋白胨稀释液
    将8.5g氯化钠和1.0g胰蛋白胨溶解于1000 mL蒸馏水中。调节pH至7.2±0.1。分装225 mL于250 mL广口瓶中，121℃高压灭菌15min。
    A2 亚硫酸铁琼脂
    胰蛋白胨 15.0g
    大豆蛋白胨 5.0g
    酵母浸膏 5.0g
    偏重亚硫酸钠 1.0g
    柠檬酸铁铵 1.0g
    琼脂 20.0g
    蒸馏水 1000g
    将各成分混匀，加热溶解，调节pH至7.6±0.1，分装于500 mL锥形瓶中各250 mL，121℃高压灭菌15 min。一周内用完。
    A3疱肉培养基
    牛肉浸液 1000 mL
    蛋白胨 30.0g
    酵母浸膏 5.0g
    磷酸二氢钠 5.0g
    葡萄糖 3.0g
    可溶性淀粉 2.0g
    碎肉渣 适量
    取碎肉渣分装15mm×150mm试管约2-3cm高，将上述液体培养基分装至每管内超过肉渣表面约1 cm。121℃高压灭菌15 min。
    A4 过氧化氢酶试验
    挑取培养物一接种环，置于洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液（临用时配制）2mL，于半分钟内观察发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。

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