重组大肠杆菌DH5α发酵培养基的优化

  重组大肠杆菌DH5α发酵培养基的优化

张怡洁，李聪，王鹏，申烨华，张英起

摘要：为了提高重组大肠杆菌DH5α生产rNGR—Tum一5，研究了培养基中不同种类的碳氮源物质和微量元素对工程菌生产蛋白能力的影响。得出在培养基组分(％)为：甘油1，酵母粉3，蛋白胨1，氯化钠0.5，微量元素母液150μm时，重组大肠杆菌DH5α生产rNGR- Tum一5最强，较初始培养基提高了5倍。 

Tumstatin(胶原IVα3 链的非胶原区域1 )是一种内源性血管生长抑制因子。Turn一5是由Tumstatin接近N端的54—132位氨基酸组成的，它是Tumstatin抗血管形成的功能结构域，含有5个半胱氨基酸，与全长的Tumstatin具有同等的抗血管生成效能，但可降低其引起肺一肾出血综合症的副作用。NGR是从噬菌体展示文库中筛选出的一种可以和肿瘤新生血管特异性结合，含13个氨基酸的寡肽。目前，基于NGR导向肽所建立的以肿瘤血管为靶位的治疗策略已经广为应用。rNGR—Turn -5是一种抗肿瘤血管生成的基因工程药物， 既具有肿瘤血管导向性，又是内源性肿瘤血管生成抑制剂的衍生物。本研究对培养基的主要成分—碳、氮源进行了优选，并考察了微量元素对菌体生长和蛋白表达的影响，以期提高rNGR—Turn一5的产量，为其工业化生产提供依据。 

1 材料与方法

1.1 菌种

E．coli DH5α／pQE—TN(rNGR—Turn一5 )工程菌由第四军医大学生物技术中心构建。

1.2 培养基

常用培养基LB、M9、SOB、MBL。 

微量元素母液的配制：每1L溶液中含有：FeCl3·6 H2O  3.24g，ZnCl2  0.22 g，CoC12·6H2O  0.24 g，NaMoO4·2H2O 0.24g，CaC12·2H2O  0.12g，CuSO4·5H2O  0.20g，H3BO3  1.0g， MgSO4  0.74g 。

1.3 试剂

酵母粉、蛋白胨系英国Oxoid产品，蔗糖、葡萄糖、甘油、N H4C1、N aCl等均系国产分析纯试剂。 

1.4 培养方法

-70℃甘油管冻存之工程菌划线接种于含氨苄 (Amp )的LB固体琼脂平板中，37℃孵箱放置 12h，挑取单克隆接种于装有5mL指定培养基的小试管中，在30℃，200 rpm的摇床上活化振荡过夜。8h 后取2m L菌液以1：100比例接种于装有200m L指定培养基(含100g／mLA mp)的摇瓶中，37℃进行培养。进入对数期中期后，加入IPTG( 0. 5mmol／L)诱导，4h后4200  rpm离心20 min，收菌。 

1.5 菌体浓度的测定

比色法测定，以600nm波长处的光密度 OD600表示。

1.6 蛋白rNGR—Tum一5表达量的测定

发酵液菌体做SDS — PAGE，用Band—scan软件测定rNGR—Turn一5表达量。 

2 结果与讨论

2.1 不同培养基对菌种生长及蛋白表达量的影响

提取菌种质粒，并转化至感受态细胞，在LB琼脂培养基上划板，挑选出表达量高的单克隆做为菌种以供后续实验使用。分别用培养基LB、M9、SOB、MBL在同一条件下培养菌种， 分别考查不同培养基对重组大肠杆菌DH5α的生长量和目标蛋白一GR—Tum一5表达量的影响，实验结果见表1。由表1可见，工程菌在LB培养基中生产rNGR—Tum一5的能力最大，为0.54。所以选定LB培养基进行优化实验。

表1 四种培养基中蛋白生产能力

2 _ 2 培养基中碳源的优化

工程菌多采用甘油、葡萄糖、蔗糖做为碳源，因此分别添加不同浓度的甘油、葡萄糖、蔗糖与不含碳源的初始LB培养基作对照，考查不同种类、不同浓度的碳源物质对重组大肠杆菌DH5α的生长量和rNGR—Turn一5 表达量的影响情况，实验结果可知添加甘油和葡萄糖后，终止OD由4.5最高可增长到6.9 (葡萄糖或甘油1％处)，高于不加碳源时的水平； 而添加蔗糖时，对终止OD600影响程度较小，由4.5最高可增长到5.9；随着碳源浓度的增高，终止OD都是先升高后降低，有一个最优值。这可能是因为碳源浓度过高时，糖代谢产生过量的酸性物质，使菌体生长的微环境恶化，影响某些酶的活性，抑制了菌体的生长。

培养基添加碳源后，rNGR—Tum一5的表达都有不同程度的提高。其中甘油的添加影响效果最明显，使目标蛋白碳源对rNGR—Tum一5表达量的影响的表达量由12％提高到28％，添加葡萄糖，蔗糖使目标蛋白的表达量由12％分别提高到22％和20％。并且随着碳源浓度的增加，目标蛋白的表达同样经历了一个先升后降的过程。

以碳源浓度为横坐标，rNGR—Tum一 5的生产能力为纵坐标，可看出甘油浓度在1％时，工程菌生产NGR—Tum一 5的能力最强，所以选定1％的甘油为碳源物质。碳源对工程菌生产rNGR—Tu m一5能力的影响

2.3 培养基中氦源的优化

原LB培养基中含有2种氮源(酵母粉和蛋白胨)，蛋白胨含量保持不变(1％)，酵母粉的添加量发生变化；酵母粉含量保持不变( 0.5％)，蛋白胨的添加量发生变化；酵母粉(0.5％)和蛋白胨(1％) 含量都不变，氯化铵的添加量发生变化。选择1％ 的甘油为碳源物质，氯化钠含量保持不变，考察不同种类、不同浓度的氮源物质对菌种生长和rNGR—Tum一5表达情况的影响。 

可知，与含有单一氮源物质相比，增加有机氮源酵母粉和蛋白胨能有效促进菌体的生长，酵母粉的添加使终止OD 从 3.5 提高到8.1，蛋白胨的添加使终止OD从3.8提高到 7.8。在复合氮源(酵母粉0.5％，蛋白胨1％) 的基础上，添加无机氮源氯化铵的影响甚微，使终止OD从6.9提高到7.3。与碳源的添加类似，随着氮源浓度的升高，终止OD有一个先升后降的趋势。氮源物质的添加能不同程度提高蛋白的表达量。其中酵母粉的添加能使蛋白的最高表达量从 12％提高到38％，而蛋白胨和氯化铵的添加分别使蛋白的最高表达量从10和28％提高到35％和37％。并且随着氮源浓度的增大，目标蛋白的表达仍经历了一个先增后减的过程，可能是因为氮源过多时，氨基酸的代谢产物对菌体生长和目标蛋白的表达有抑制作用引 。

 以氮源浓度横坐标，rNGR—Tum一5的生产能力为纵坐标，在酵母粉浓度为3％，蛋白胨浓度为1％时，目标蛋白生产能力最强，可达3.4。所以选定氮源成分为 3％ 的酵母粉和1％的蛋白胨。 

2.4 培养基中微量元素的优化

微生物在生长繁殖过程中，需要某些无机盐如磷，镁，硫，钾，钠等，以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。这些物质一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。而各种不同微生物及同种微生物在不同的生长阶段对这些物质的最适浓度要求均不相同，因此在生产中要通过实验预先了解菌种对微量元素的最适需求量，以稳定或提高产量。

在100m L选定的培养基中分别添加0，50，100，150，200μl 微量元素母液，培养基用空白，A，B，C，D表示。实验结果见表2 。 由表2可见，添加微量元素后，终止OD和目标蛋白的表达略有提高，其中添加微量元素母液150 μL时，终止OD最大，为表2微量元素对工程菌生长情况及蛋白表达的影响8.4，同时rNGR—Tum 一5 表达量也最大， 为42％。 

表2 微量元素对工程菌生长情况及蛋白表达的影响

2.5优化培养基实验

优化后的培养基记为LB1，组成成分是甘油1％、酵母粉3％、蛋白胨1％、氯化钠0.5 ％。LB1与LB培养基的实验结果见表3。为 rNGR—Turn一5在两种培养基中表达量的对比。

由表3可，与初始LB培养基相比，优化后培养基LB1使菌体终止OD600由4.5提高到8.4，rNGR—Tum一5表达量由12％提高到42％，目标蛋白的生产能力也随着大幅增长，由0.54增长到3.5，较初始提高了5倍，为工程菌的高密度发酵奠定基础。 

表3

参考文献（略）

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