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论沙门氏菌的检测方法



录入时间:2010-11-5 10:28:10 来源:食品安全

 

沙门氏菌是食品微生物中致病菌的一种,下面介绍几种检测沙门氏菌的方法。 

1、传统的培养方法

用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌,以增加病原的可检出率,共有如下四步: ( 1 )预增菌,将样品加到培养基中,温度37,使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。( 2 ) 选择增菌,使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少,目前选择性培养基有3种类型:连四硫基盐肉汤、硒酸盐胱氨酸肉汤和 RV培养基。( 3 )分离,即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养,然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认。并对该菌落分离物进行生化和血清学检测,以 做出鉴定。

2 以核酸为基础的方法

所有的细胞都含有DNARNA这样唯一一类可携带信息的大分子,所以用它作为检测的标靶。 标靶通常是一个特异性核酸序列,它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。探针需要加附适当的标记,此法应用的探针含有放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片段, 其敏感性高,经约48小时的增菌步骤后, 检测极限可达1 08个细菌/m l 。目前,以核酸杂交为基础的第二代技术——比色计目前也已发展起来,此法依赖于沙门氏菌核糖体 RNA( rRNA) ——核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。核糖体是细胞蛋白质合成器的一部分,每个细菌细胞中存在5000 ~ 20000个复制体,而相比之下染色体 DNA复制体仅 2 ~10个。 这种天然富含r RNA标靶序列的情况使得用无辐射计检测成为可能,同时又保持了与放射性同位素方法相当 或更高的敏感性。 

3、以抗体为基础的检测方法

利用抗原——抗体反应的特异性,进行细菌的鉴别和血清学定性。细菌菌体或鞭毛抗原的特异性抗体的存在,使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。广泛采用的是以双位点ELISA技术即夹心ELISA为基础的方法。此法是指以固定在固体基质上的“捕捉”抗体来捕捉目标抗原,经洗涤除去未结合的成分,加入第二种酶标抗体,此者结合在捕捉到的抗原的不同位点上,第二次洗涤后加入酶作用基质,并令其与颜色成分反应,然后用分光光度法即很容易检测到目标抗原。采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化,并促成其自动化。

ELISA法检出沙门氏菌的极限范围在105-106个细胞/ml,因此,要得出可靠的结果,食物样品首先必须进行预增菌、选择性增菌,通常还要在含有D一甘露糖的肉汤( M肉汤) 中进行后增菌,以促进鞭毛发育。标准的ELISA法样品制备,经40 ~ 48 小时的孵育才能完成。目前国内口岸系统已应用微量板ELISA法对进出口动物产品进行沙门氏菌检测。该法采用预先包被了沙门氏菌( A- E) 单克隆抗体的微量板,加入经增菌处理的样品,反应后再加入一定的指示剂, 作用毕后用酶标仪测定OD值来判定结果,微量板ELI SA法样品制备过程分三步,共耗时24小时。( 1 ) 选用营养肉汤进行预增菌6小时,使“致伤”、冷冻的沙门氏菌复苏。( 2)使用选择性培养基RV进行增菌14小时,使沙门氏菌大量繁殖,同时抑制其它杂菌生长。(3) 使用营养肉汤( 蛋白胨水) 进行后增菌4小时,使沙门氏菌的数量大大增加。 

4、快速检测方法

(1)平板检测方法。第一阶段,在小孔内加入样品和抗体联合物,孵育期间,沙门氏菌抗原和包被抗体形成了一种复合物:包被单克隆抗体——沙门氏菌抗原——抗体联合物。洗涤后,通过每孔加入基质溶液 ( 过氧化脲) 和色素原溶液( 四甲基氨基丙苯) 来显示上述复合物 :酶催化色素原的氧化,结果产生蓝色。加入反应终止液终止催化反应,并使反应混合物酸化,颜色由蓝变黄。( 2 ) 卡片检测法。 此法以单步免疫反应即夹心型免疫色谱反应为基础。反应固相包括一块用“抗沙门氏菌抗体——染料”偶合物浸透的染料衬垫和一张薄膜条,抗沙门氏菌抗体就固定在薄膜的反应区上。增菌后,增菌肉汤用移液管加到样品小孔内并令其吸收, 如样品存在沙门氏菌抗原,它们会与偶合物作用,然后依次迁移到膜上,与固定在膜上反应区的抗体结合,在反应窗上呈现一条色带。最后结果可在 5 ~ 7秒内读取。 

 

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