阪崎肠杆菌研究进展

【 摘要】   阪崎肠杆菌属肠杆菌科肠杆菌属，是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽胞杆菌，属条件致病菌，能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50％以上。阪崎肠杆菌耐酸、耐高温、耐干燥，对外界环境有较强的抵抗力。阪崎肠杆菌的微生物学检验方法，包括传统细菌学培养方法及各种基于聚合酶链反应( PCR) 的分子生物学方法。   ． 

阪崎肠杆菌(Enterobacter  Sakazakii ) 是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽胞杆菌，属肠杆菌科肠杆菌属，一直被称为黄色阴沟杆菌( Yellow  Pigmented   Enterobacter  cloacae )， 直到1980年才由FARMER和他的同事更名为阪崎肠杆菌。因阪崎肠杆菌是肠道正常菌群中的一种，属条件致病菌，一直未被临床引起重视，直到1961年，英国的URME NYI和FRANKLIN 两位医生首次报告了由该菌引起的两例脑膜炎病例，随后丹麦、美国、荷兰、希腊、冰岛、比利时等国家相继报道了新生儿阪崎肠杆菌感染事件。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎，并可能遗留严重的神经系统后遗症，死亡率20％～50％。国外文献报道最多的是阪崎肠杆菌污染了婴儿配方奶粉，引起婴幼儿感染。也有几例成年人感染病例的报告。阪崎肠杆菌分离检测方法，国际上通常以美国FDA   2002年8月发布的“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离计数” 作为经典方法，在此基础上做了较多的改良方法及分子生物学检测方法。我国也与2005年8月颁布了奶粉中阪崎肠杆菌检测方法。临床上对阪崎肠杆菌的病原学检测方法报告较少。本文就阪崎肠杆菌的主要微生物学特性，致病性，分离检测作一综合性介绍，以飧读者。 

1   阪崎肠杆菌微生物学特性

1.1形态染色    阪崎肠杆菌属肠杆菌科肠杆菌属， 因此本菌具备肠杆菌基本形态特征：革 兰阴性粗短杆菌，细胞大小为( 0.6～1.1 )×( 1.2～ 3.0 )， 有周身菌毛，无芽胞， 有动力。 

1.2 培养特性

12.1   营养要求    不高，能在普通营养琼脂、血平板、麦康凯( MAC )琼脂、伊红美兰( EMB) 琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。 

1.2.2 培养温度    阪崎肠杆菌具有耐热及耐寒性，在外界环境中比其他肠道杆菌生存率强，培养最佳温度25—36℃，在6～45℃下都能生长，某些菌株可在47℃下生长 。 

1.2.3  菌落特征   在胰蛋白胨琼脂( TSA)、脑心浸液琼脂(BHI )及血平板上经 25～36℃培养24 h后，形成1.5～2.5 mm，黄色菌落， 菌落形态有2种：一种为典型的光滑型菌落，极易被接种环移动，另一种为干燥或粘液样，周边呈放射状，不易被接种环移动，似橡胶状有弹性。后一种经传代后可转化为有光泽的菌落。

1.2.4 菌落颜色   阪崎肠杆菌在MAC琼脂上为无色透明菌落，在TSA及BHI上生长为黄色菌落，在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBG) 能产生紫红色菌落，而在TSA上加 5- 溴-4-氯-吲哚-α- D- 吡喃葡萄苷( Xα-GLC ) 仅阪崎肠杆菌能产生兰绿色菌落，现已作为阪崎肠杆菌快速培养的选择性培养基，在4-甲基- 伞形酮-α- D- 葡萄糖苷( NA+α-MUG) 培养基上产生荧光菌落。 

1.3   生化反应   阪崎肠杆菌在定名前一直被伯杰分类为产黄色素的阴沟肠杆菌，实际上是阴沟肠杆菌的一个亚种，因此与阴沟肠杆菌的生化反应有许多相似的地方。阪崎肠杆菌与阴沟肠杆菌有31％～49％的DNA序列同源性，G+C含量为57％。

MUYTJENS等在对226株(其中129株为阪崎肠杆菌，其他为阴沟肠杆菌60株，产气肠杆菌19株，聚团肠杆菌18株)肠杆菌的研究中，发现阪崎肠杆菌和其他肠杆菌之间存在两个主要的不同：阪崎肠杆菌α-葡萄糖酶苷活性均阳性，而缺乏磷酰胺酶活性。由此认为，凭两种酶活性检测可将阪崎肠杆菌与其他肠杆菌明显地区分开来，并且将α-葡萄糖酶苷活性检测可用来快速分离阪崎肠杆菌。

POSTUPA研究了从婴儿配方奶粉中分离到的6株阪崎肠杆菌，发现所有的菌株都能产生吐温-80脂酶。因此， 吐温-80脂酶活性测定也可以作为阪崎肠杆菌的鉴定依据。

1.4. 抵抗力

1.4.1  耐高温、干燥、渗透压   阪崎肠杆菌比其他肠杆菌耐高温，LEHNER 研究发现阪崎肠杆菌在婴儿配方奶粉中60℃存活2.5min，并且72℃仍能存活。BREELLWER等观察阪崎肠杆菌在58℃下能持续0.39～0.60min不死。由于阪崎肠杆菌细胞内含有大量的海藻糖酶，累积有大量的海藻糖，使得阪崎肠杆菌比沙门菌和其他肠杆菌更耐受渗透压和干燥。因阪崎肠杆菌这些特性，使得奶粉生产时不易被杀灭，储存时易生存下来。

1.4.2   耐酸性并对清洁剂和杀菌剂有较强抵抗力LEH—NER的实验表明，阪崎肠杆菌能在 pH0.9～2下存活(胃部的酸性环境)，可能与阪崎肠杆菌周身菌毛结构有关，该菌毛结构易使细菌形成共生集合体，也易粘附在各种物体表面形成一层生物保护膜，对清洁剂和杀菌剂具有较强的抵抗力。 

2 阪崎肠杆菌临床意义

阪崎肠杆菌可引起各年龄段人群的疾病，但从已报道的病例年龄分布来看，婴幼儿(1岁以下的儿童)是该菌感染的高危人群，特别是新生儿、早产儿、出生体重偏低、免疫力低下等身体状况较差的婴儿。感染主要引起脑膜炎、脓毒血症、坏死性小肠结肠炎；阪崎肠杆菌引起的脑膜炎常引起脑梗塞、脑脓肿和脑室炎等并发症，并且可引起神经系统后遗症，死亡率较高。成人主要是引起局部感染和菌血症。

2.1   致病因素    文献对阪崎肠杆菌的致病因素报道不多，所知甚少。目前所知阪崎肠杆菌致病性与类肠毒素和内毒素有关。PAGOTTO首先描述阪崎肠杆菌可能产生一种毒力因子——类肠毒素样化合物，经腹腔注射板崎肠杆菌剂量达10CFU／只时。18株实验菌株均可导致乳鼠死亡，其中4例检测到类肠毒素样化合物。国内许龙岩等观察小鼠在接种阪崎肠杆菌菌液6小时后出现中毒症状，8小时后中毒症状加深，24小时后全部死亡。经解剖发现实验鼠小肠肿胀，有气泡，肠壁变薄、糜烂，肠系膜血管、腹膜血管变粗、充血。最近，TOWNSEND 等发现婴儿配方奶粉中含有细菌脂多糖——内毒素(LPS )，具有热稳定性，能增加小肠上皮细胞通透性，促使细菌侵入肠壁中而致病。他将纯化的肠杆菌属脂多糖与阪崎肠杆菌一起经注射入乳鼠腹腔中，能明显提高阪崎肠杆菌穿透血脑屏障的能力，该实验虽未明确表明阪崎肠杆菌产生内毒素，但推测阪崎肠杆菌的致病性与细菌内毒素有明显的关联。

MANGE等通过体外组织细胞培养实验观察到阪崎肠杆菌对人类上皮细胞和脑微血管内皮细胞有吸附粘连特性，并形成丛生，表面形成生物保护膜。

KIM等支持上述实验结果，他们利用不锈钢管、玻璃管及PVC塑料管腔内壁，只要有一定营养液和适宜温度，阪崎肠杆菌就可以在这些管腔内吸附生存，并形成生物保护膜，抵御消毒剂等的杀伤作用。

2.2 所致疾病

2.2.1   婴幼儿脑膜炎   自从1961 英国的FRANKHN等首次报道了2例由阪崎肠杆菌(当时被描述为产黄色素阴沟肠杆菌)引起的脑膜炎病例，随后世界各国陆续报道了由该菌引起的婴幼儿脑膜炎。1983年MUYTJENS等对荷兰地区6年来发生的8例阪崎肠杆菌引发的婴幼儿脑膜炎作了回顾性调查分析。发现未足月出生的新生儿占75％，出生时低体重 (<2000g )的新生儿易感染(6／8)，并与人工喂养奶粉有关。主要症状：发热、面色苍白，有抽搐或颤抖，张力亢进，囱门隆出，无颈项强直。合并有菌血症者占5／8，坏死性小肠结肠炎占2／8，死亡率高达75％(6／8 )。2例存活的病人中伴有严重的神经系统后遗症。在大部分病例的脑脊液和血液中分离到阪崎肠杆菌。Biefing等在1989年报告了3例住在冰岛首都国立大学附院新生儿重症监护室病人，1例正常出生但伴有左脑损伤，1例是Down’s 综合症(先天性无肛门)，另1例为健康的男性双胞胎之一，他们共同特征是人工喂养婴儿配方奶粉5天后发病，出现发热、精神萎靡、嗜睡、脑脊液可见大量的嗜中性粒细胞，培养分离均找到阪崎肠杆菌，除1例死亡外，1例发展为四肢瘫痪、痴呆，另1例为阵发性癫痫病。 BOWEN等分析46例阪崎肠杆菌感染的病例，其中脑膜炎的发病率是72％(33／42)，在33例的脑膜炎病例中有33％发展为癫痫，21％有脑脓肿，死亡率42％。 

2.2.2  新生儿菌血症    该病例最早报告的是在1979年，MONROE 发现一出生6天(体重2600g)的患儿出现低热(38.3℃)、寒颤，白细胞偏低，其血液培养分离到阪崎肠杆菌，经氨替比林治疗后痊愈，未发生脑膜炎。

 阪崎肠杆菌感染新生儿发生的菌血症，据BOWEN对46例该菌感染的新生儿分析，其发病率是38％(12／42 )。多数症状较轻，如出现严重的脓毒血症，死亡率可达36％。

2.2.3  新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)   ACKER等报告了比利时一家医院的新生儿重症监护室在1998年6—7月间共有12例阪崎肠杆菌引起的NEC暴发事件，12例NEC都经临床确诊，这些患儿的特点是：均未足月出生，体重全部低于2000g，最低体重590g，平均体重只有1177g，人工喂食奶粉。胃液分离到阪崎肠杆菌7例(7／12)，肛指液分离到9例(9／12 )， 血液分离到4例(4／12)，死亡2例(2／12) 。 

2.2.4 成人感染   阪崎肠杆菌引起成人感染的报告虽不很多，但从现有资料看涉及到成人各年龄段都有发生。本菌是条件致病菌，当机体因其他疾病导致免疫功能低下时，可引起菌血症、脓毒血症及泌尿道、呼吸道、创伤面感染，也可引起脑膜炎、胆囊炎。周庭银等报告的3例阪崎肠杆菌感染其中败血症1例(女，45岁)，尿路感染1例(女，55岁)，中耳炎1例(男，21岁)。龚燕等报告从64例痰液中分离到阪崎肠杆菌，其中有62例(96.7％患有基础疾病：慢性阻塞性肺疾病24例，呼衰7例，糖尿病6例，肺结核2例，肺癌2例，近期化疗8例，肠梗阻2例)。最近，See等报告一个75岁老妇患多发性脾脓肿合并阪崎肠杆菌菌血症。 

3   阪崎肠杆菌微生物学检验

3.1   细菌学分离培养方法

3.1.1   经典方法    所谓经典方法，即是美国FDA推荐的“三管法” 培养分离阪崎肠杆菌的方法。基本步骤如下：(1)以无菌称取100、10、1g婴儿配方奶粉用无菌蒸馏水以1：10稀释，充分溶解后36℃24h 孵育；(2)充分混匀后分别取10 ml加入至装有90mlEE肉汤增菌培养36℃24h；(3)充分混匀后用直接涂布法或直接划线接种法，在VRBG平板中孵育36℃24h；(4)从每个VRBG平板中挑取5个可疑菌落，分别接种在TSA平板25℃48～72 h；( 5 ) 在TSA平板上挑取黄色、无光泽典型菌落在API20E进行鉴定。该方法自2002年被推荐公布以来，一直是各国沿用的阪崎肠杆菌鉴定检测的方法，缺点是时间太长，需时7天左右，灵敏度不高。

3.1.2   改良法： XαGLC选择性显色培养基法    该法是利用阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶活性的检测方法，在TSA培养基中加入了5-溴-4-氯-吲哚- α-D-吡喃葡萄苷( XαGLC)作为发色基团，组成显色培养基，称为(DFI) 琼脂。该法的原理是葡萄糖苷酶水解XαGLC，释放糖苷配基5-溴-4-氯- 吲哚，该糖苷配基在氧存在时形成色素溴-氯- 吲哚，使菌落呈现特异性蓝绿色。该改良法已被广泛应用，相对经典方法能缩短时间2天左右，且特异性高。

3.1.3   改良法： 荧光选择性鉴别培养基法    该方法也是利用α-葡萄糖苷酶活性的检测方法。在营养琼脂基础上添加4-甲基-伞形酮-α- D-葡萄糖苷(α-MUG)。阪崎肠杆菌在该培养基上形成黄色菌落，在紫外光照射下发生荧光。该法灵敏度和特异性都比较好，已在多个国家开展使用，均取得稳定可靠的结果。 

3.1. 4 改良法： 对硝基酚光电比色法     利用阪崎肠杆菌的α-葡萄糖苷酶活性，分解对硝基酚-α-D- 葡萄糖苷底物，释放黄色的对硝基酚，在405 nm波长下测定吸光度，根据吸光度的大小，确定样品中阪崎肠杆菌是否存在。方法是常规增菌，在VRBG或TSA平板上挑取可疑菌落，制备成一定浓度的菌悬液与底物混匀，37℃ 4h后进行比色测定。

3.1.5   阳离子磁性珠快速捕获法  MULLANCE等设计了革兰阴性杆菌捕获系统，能快速富集阪崎肠杆菌。他将普通珠子经过顺磁化后，使其表面带有阳离子(正电荷)，能极强地吸附带有阴离子(负电荷)的物质；革兰阴性杆菌表面的脂多糖就是带阴离子(负电荷)的物质，故阳离子磁性珠能捕获含有脂多糖的革兰氏阴性杆菌。MULLANCE将该系统设计成自动化，即将婴儿配方奶粉溶解后，通过管道输送至捕获器，反复与磁性珠接触，使阪崎等革兰阴性杆菌被吸附在磁性珠表面，然后在蛋白胨缓冲液中洗脱细菌；整个过程在6h内完成。然后将浓缩的菌液划线，接种在选择性显色培养基(DFI) 或通过PCR分子生物学方法鉴定。使用该方法，最多在48h内鉴定出阪崎肠杆菌，比美国FDA经典方法缩短5天左右，并且灵敏度很高，可检出1～5CFU／500g 奶粉。 

3.2 分子生物学方法

3.2.1   PCR方法    IVERSEN等利用16SDNA基因序列的PCR方法，对126株被API20E和ID32E自动化鉴定为阪崎肠杆菌，其中有几株是ATCC的标准菌株，进行了核苷序列分析。发现阪崎肠杆菌与柯氏枸橼酸杆菌最接近，有97．8％同源，而与阴沟肠杆菌只有97％同源； 利用16S DNA核苷序列分析，可将126株阪崎肠杆菌进一步分为四个亚群：与标准菌株相比，有0.1％-1.2％序列不同的分为I群，共有110株；有1.6％-1.9％序列不同分为Ⅱ群，共有9株；有97.5％-97.8％同源分为Ⅲ群，包括分类为Pyfinus肠杆菌、霍氏肠杆菌和柯氏枸橼酸杆菌，共有5株；第 Ⅳ群仅2株，只有96.5％同源性。 

LEHNER等则采用针对16S   rRNA基因序列的PCR方法。他们对47株不同来源的阪崎肠杆菌和28株其他肠杆菌进行了分析，经与基因库标准菌株对比，47株阪崎肠杆菌有99.4％-100％同源性，28株非阪崎肠杆菌则全部阴性,特异性很强，灵敏度可达10 pg。

MANOJ等设计了针对阪崎肠杆菌外膜蛋白A基因(OmpA)序列的PCR方法，所设计的产物能特异性地扩增阪崎肠杆菌的DNA片段，扩增产物为469bp 。OmpA基因是阪崎肠杆菌具有的独特性位点，其他G肠道杆菌无此基因。因此，该PCR方法特异性非常高，检测灵敏度在婴儿配方奶粉直接检测可达10CFU／ml，如通过8小时培养则可达10³ CFU／ml，是一种理想的快速检测阪崎肠杆菌的方法。 

3.2.2  定量PCR方法   定量PCR是在一般PCR法基础上发展起来的一种分子生物学定量方法。目前国内外最常使用的是实时荧光定量PCR技术(real—time  PCR )。最早使用该技术是上个世纪90年代美国PE公司开发的Taqman荧光探针定量技术，称经典方法。之后在此基础上发展出了杂交探针法，以及荧光引物法等。荧光定量PCR技术的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，该基团是一对合适的荧光物质，可以构成一个能量供体和能量受体对，其中供体的发射光谱和受体的吸收光谱重叠，在PCR反应基因扩增时，激发供体而释放的荧光能量正好被受体吸收，使得供体的荧光强度减弱而受体荧光强度增强，利用荧光信号强弱变化积累实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 

实时荧光定量PCR技术已广泛应用于多种食品微生物污染的检测。SEO等利用阪崎肠杆菌部分大分子合成( MMS )操纵子基因序列建立了奶粉中阪崎肠杆菌的实时荧光定量PCR方法，能检测到0.6g-1奶粉中的阪崎肠杆菌，且比传统培养法检测时间从 6～7天缩短至2天内完成。对68株阪崎肠杆菌和55株非阪崎菌进行检测，未出现假阳性和假阴性，具有很好的特异性。 

4 小结

阪崎肠杆菌主要通过婴儿配方奶粉传播能引起严重的新生儿疾患，死亡率高达50％以上，已引起了FAO／WHO及各国的高度重视。近几年国内也有陆续报道，根据笔者搜索到有关阪崎肠杆菌的文献资料，国内外报道最多的是食品安全问题，临床医学界尚未引起足够的重视，对阪崎肠杆菌对人体的致病因素、致病机理尚未深入研究；阪崎肠杆菌是条件致病 菌，在外界环境中的存在有较多研究，但对人体正常菌群中阪 崎肠杆菌的分布、阪崎肠杆菌的传播、流行、耐药等缺少相关资料。通过本文对阪崎肠杆菌的主要生物学性状，致病因素，所致疾病、培养检测方法等作了简要综述，望能引起医学界同仁的广泛关注，起到抛砖引玉作用。 

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