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醋酸菌培养条件的优化及醋酸分批发酵

录入时间:2010-11-9 10:26:28 来源：生物化学资料网

摘要:目的醋酸菌培养条件的优化与醋酸发酵实验。方法通过正交试验确定最佳培养条件,并在优化条件下进行分批发酵。结果优化培养条件为:葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,乙醇10%(v/v),pH 5.5,装量50 mL/500 mL,静置培养5 d。在优化条件下,醋酸产量比用普通产酸培养基提高了36.4%。应用于分批发酵试验产酸较高。结论优化培养条件适合醋酸菌生长与醋酸发酵。
　　关键词:醋杆菌属巴氏醋杆菌;培养条件;正交设计;分批发酵
　　山西老陈醋不仅是具有“绵、酸、香、甜、鲜”独特风味的调味品,还因其富含多种氨基酸、维生素和微量元素而作为保健品得到广泛使用。近年山西醋业发展迅猛,生产规模日渐扩大,生产技术日新月异,促进了山西老陈醋的发展。在食醋生产中,菌种起着至关重要的作用。一株优良的生产菌株能起到提高产量、稳定质量的目的。本实验室从醋醅中分离到一株醋杆菌属巴氏醋杆菌S12,经N+离子注入诱变获得高产突变株SM12-87。对其培养条件进行了优化设计,得出了最佳培养条件。在正交试验对醋酸菌发酵条件掌握的基础上,通过液态分批发酵对优化后的培养条件进行检验。在67 h生产出92.8 g/L的醋酸,乙醇转酸率达到90.08%,极大地缩短了生产周期,减少了成本。
　　1仪器与材料
　　 1.1材料
　　山西老陈醋醋醅(由山西老陈醋集团有限公司提供);醋杆菌属巴氏醋杆菌(Acetobacter past-eurianus)SM12-87(本实验室保存)。
　　1.2主要设备仪器
　　全自动式5 L发酵罐(Edison.N.J.,USA);GC9800型气相色谱仪(上海科创公司);HQL150B型恒温摇床(中科院武汉科学仪器厂)。
　　1.3培养基
　　1.3.1产酸培养基葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,pH 5.5,分装于500 mL三角瓶,每瓶100 mL,121 ℃灭菌20 min,使用前加入7%(v/v)无水乙醇。
　　1.3.2发酵培养基葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,硫酸镁0.5 g/L,pH 5.5,121℃灭菌20 min,冷却至60 ℃以下加入10%(v/v)无水乙醇。
　　1.4培养条件优化试验[1]
　　利用正交表L27(313)设计试验,见表1。分析各因素对醋酸产量的影响。
　　表1因素水平表
　　
　　D1,D2,D3分别代表50 mL培养基在500 mL三角瓶中以100 r/min振荡培养,150 r/min振荡培养,静置培养。
　　1.5最佳接种量、培养温度和酒精度的选择
　　醋酸菌SM12-87在优化培养条件下,以不同接种量、培养温度和乙醇含量进行培养,选择最佳接种量、培养温度和酒精度。
1.6优化培养条件的验证试验
　　醋酸菌SM12-87在优化培养条件下培养,以优化前的产酸培养基在30 ℃,100 r/min摇床培养3 d作为对照。测定总酸度和乙酸乙酯含量。

1.7检测方法
　　总酸度的测定:滴定法[2]。
　　乙酸乙酯测定:气相色谱测定法[3]。
　　乙醇转酸率计算公式[4]:
　　
　　还原糖测定:3,5-二硝基水杨酸法[5]。
　　氨基氮测定:甲醛滴定法[6]。
　　1.8醋酸菌SM12-87的分批发酵试验[7]
　　利用优化培养条件配制发酵培养基,用全自动5 L发酵罐进行醋酸分批发酵。2结果与讨论
　　
　　2.1培养条件
　　根据单因子试验,影响醋酸产量的主要因素有:葡萄糖+酵母膏,乙醇含量,pH,溶氧,培养时间。采用L27(313)正交表进行培养条件优化试验。实验结果见表2、表3。
　　表2 以醋酸产量为检测指标的正交试验直观分析表
　　
　　由极差分析的R值可以看出,影响产酸的各因素主次顺序为D > E > A> C >B;最佳工艺条件为A2 B1C2 D3 E3。
　　表3以醋酸产量为检测指标的正交试验方差分析表
　　
　　**表示影响高度显著;*表示影响显著
　　F1-0.1(2, 12)=2.81,F1-0.05(2, 12)=3.89,
　　F1-0.01(2, 12)=6.93
　　F1-0.1(4, 12)=2.48,F1-0.05(4, 12)=3.26,
F1-0.01(4, 12)=5.41
　　由方差分析表可见,D对醋酸菌的产酸影响高度显著,A、E对醋酸菌的产酸影响显著, A与B、A与C的交互作用对产酸有一定影响,A与D的交互作用对产酸影响不显著。从方差分析可知,溶氧条件D3对产酸影响非常显著。由此可见,醋酸菌虽然是好氧菌,但过高的溶氧对醋酸菌的生长和产酸都是不利的。
　　由直观分析表和方差分析表可知最佳工艺条件为:葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,乙醇10%(v/v),初始pH值5.5,相对装量50 mL/500 mL,静置培养5 d。
　　2.2接种量、培养温度及乙醇含量对醋酸产量的影响
　　醋酸菌SM12-87在优化条件下,以不同接种量、培养温度及乙醇含量静置培养5 d,测定醋酸产量。不同条件对醋酸产量的影响,10%的接种量产酸最高,达89.23 g/L。接种量低会延长延滞期,静置培养5 d产酸值达不到最高;接种量过高会导致菌体过早衰老、自溶,产酸值也减少。

温度/℃
　　　　30 ℃下培养产酸最高,达91.3 g/L。由此表明30 ℃为醋酸菌SM12-87的最适培养温度。

在10%的乙醇含量下,醋酸产量最高。说明醋酸菌SM12-87虽然具有很强的耐乙醇能力,但高于10%(v/v)的乙醇含量会抑制该菌生长和产酸,乙醇转化率也会显著降低;当乙醇含量低于10%时,生长速率、产酸速率和酒精转化率都较高,但总酸度相对较低。
　　2.3优化培养条件的验证
　　优化前后的培养条件下醋酸和乙酸乙酯产量,正交试验确定的培养条件是可行的。
　　　　2.4醋酸菌SM12-87的分批发酵试验
2.4.1醋酸液态深层发酵将高产突变醋酸菌株SM12-87扩大培养至对数期后期,以10 %的接种量接入发酵罐中,乙醇含量10 %(v/v),调节生长阶段温度为30 ℃~33 ℃,产酸阶段温度为30 ℃,通气量前期和后期为1∶0.1(v/v)/min、中期为1∶0.12(v/v)/min。连续2次测定酸度未上升或下降,发酵结束。
　　2.4.2分批发酵实验与发酵动力学参数
　　发酵过程主要参数变化。从菌体生长曲线可知,菌体在0~5 h为延滞期,5~15 h为对数期,15~58 h为稳定期,58~67 h进入衰亡期。在对数期,醋酸的增加随菌体的增加而增加;在稳定期,醋酸菌菌体数量不再增加,但醋酸产量继续增加;进入衰亡期产酸逐渐停止。由此可见该菌株合成醋酸是部分生长关联型。此次分批发酵,总酸度达92.8 g/L,乙醇转酸率为90.08%,至发酵结束,平均产酸速率为1.389 g·L-1·h-1。
　　 3讨论
　　验证实验的结果可以看出,通过正交试验确定的优化培养条件是合理可靠的,满足了该菌株的生理学要求。巴氏醋杆菌是一种耐酒精能力强、醋酸产量高的醋酸菌株,它在10%(v/v)酒精度下生长旺盛,静置培养5 d,总酸度可达91.67g/L。在乙醇含量为10%(v/v)的发酵培养基中液态分批发酵67 h,得到总酸度为92.8 g/L的液态醋。由于产酸速率加快,发酵时间缩短,乙醇挥发减少,酒精转化率达到90.08%,同时也减少了电耗,减轻了劳动量,降低了成本,显示了液态发酵在制醋上的优势。
　　参考文献
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　　[4]陈伟. 优质醋酸菌的选育、苹果醋酸发酵规律及酶活影响的研究[D]. 山东:山东农业大学,2001-11.
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[7]戴明辉. 液态深层发酵制醋新工艺的探索[J]. 中国酿造,2005(10):8-11

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