免疫血清对旋毛虫感染性幼虫侵入肠上皮细胞及其发育的影响

旋毛虫成囊期幼虫经口感染宿主后，在胃液和肠液的消化作用下，幼虫在十二指肠自囊包内逸出，侵入十二指肠及空肠上部粘膜的多细胞内龛（intramulticellular niche）中，经29～36 h 完成4 次蜕皮后发育为成虫[1]。小肠粘膜是旋毛虫感染宿主后的第一道天然屏障，如大鼠初次感染旋毛虫后有20%~30%的虫体在感染后24 h 从肠道中排出称为排虫反应（wormexpulsion）或快速排虫（rapid expulsion）[2]，而有免疫力的大鼠或小鼠再次感染后的排虫率为74%~99%；对感染旋毛虫的母鼠所产仔鼠（出生后14 和21 d）攻击感染旋毛虫后18 h的排虫率分别达97.5%、91%[3]。因此，旋毛虫脱囊幼虫侵入小肠粘膜内继续发育或是被宿主从肠道中排出，是旋毛虫能否导致感染与致病的关键步骤。由于不能在体外观察旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞或肠道排虫反应的过程，目前关于幼虫对肠粘膜的侵入或排出反应的机制均不完全清楚[4]。本文将旋毛虫感染性幼虫与HCT-8 肠上皮细胞在体外共培养，观察旋毛虫幼虫排泄分泌（excretory-secretory，ES）抗原或表面抗原（surface antigens）免疫鼠血清对幼虫侵入肠上皮细胞及发育的影响。
　　　　1 材料
　　　　1.1 旋毛虫、实验动物和细胞株
　　旋毛虫为河南省南阳猪源旋毛虫(Trichinella spiralis)，由本室昆明小鼠传代保种。雄性6 周龄昆明小鼠（清洁级）和雄性6 周龄BALB/c 鼠（SPF 级），体重20~25 g，均购自郑州大学医学院实验动物中心。人结肠癌细胞系（human colonic carcinoma cell line-8，HCT-8）购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。HCT-8 细胞接种于1640 完全培养基中，37 ℃ 5% CO₂ 培养箱中培养。
　　
　　1.2 主要仪器和试剂
　　人工消化液（含1%胃蛋白酶、0.7%盐酸和0.85%氯化钠），1640 完全培养基含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，上海尚宝公司生物科技有限公司）、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素，半固体培养基（含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基+1.75%低熔点琼脂糖），FITC 标记的羊抗鼠IgG 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。倒置显微镜（IX71）和荧光显微镜（BX51）均为日本奥林巴斯产品。
　　
　　2 方法
　　
　　2.1 肌幼虫的收集
　　50 只昆明小鼠经口感染旋毛虫肌幼虫（300 条/鼠）42 d 后拉颈处死。膈肌压片镜检证实感染成功后，剥皮、除内脏和脂肪，用搅拌器搅碎小鼠骨骼肌。将肌肉与人工消化液按1g∶10 ml 混合后置于42 ℃震荡消化4 h，按贝氏法收集肌幼虫，生理盐水反复洗涤后镜下计数备用[5] 。
　　
　　2.2 ES 抗原与表面抗原免疫血清的制备
　　ES 抗原与表面抗原的制备分别参照文献[6,7]操作，考马斯亮蓝测定ES 抗原和表面抗原蛋白浓度分别为1.26 mg/ml 与0.86 mg/ml。将ES 抗原与福氏完全佐剂1：1 混合后，皮下注射免疫10 只BALB/c 小鼠，间隔10d 后再用ES 抗原与福氏不完全佐剂1：1 混合后皮下注射免疫第2 次，间隔10 d 第3 次皮下注射免疫，于免疫后1 周尾静脉采血，分离血清，采用ELISA 法测定血清抗体滴度，当滴度达10⁴ 以上时，于第3 次免疫后10d 皮下注射加强免疫1 次，1 周后眶窦静脉采血，分离血清。表面抗原免疫血清的制备方法同ES 抗原免疫血清，ES 抗原与表面抗原每次免疫小鼠的剂量均为20μg/只。ELISA 检测ES 抗原、表面抗原免疫鼠血清抗体滴度分别5×10⁵ 与1×10⁵。
　　
　　2.3 旋毛虫肌幼虫的激活
　　将旋毛虫肌幼虫用含5%牛胆汁的无菌生理盐水在37℃ 5% CO2 条件下孵育2h，用无菌生理盐水洗涤3 次后，加入含抗生素的生理盐水（100 U/ml 青霉素，100 μg/ml 链霉素）中37 ℃孵育1 h，备用[8]。
　　
　　2.4 幼虫在肠上皮细胞单层中发育情况的观察
　　将 HCT-8 细胞以1×10⁶/孔的密度接种至含完全培养基的6 孔培养板中，37 ℃ 5% CO2培养24 h，镜下观察HCT-8 细胞贴壁生长至成致密的单细胞层。将激活后的幼虫加入半固体培养基中，然后覆盖到HCT-8 细胞单层，37℃ 5% CO₂ 培养，分别在12、18、24、36、72 和96 h 时镜下观察幼虫的蜕皮及发育情况。
　　
　　2.5 免疫血清对幼虫侵入肠上皮细胞及发育的影响
　　将 200μlES 抗原或表面抗原免疫鼠血清与1800μl半固体培养基充分混合后加入约100条激活后的幼虫，然后覆盖到培养HCT-8 细胞的6 孔板的其中1 孔中，分别接种4 孔，37 ℃5% CO2 培养15 min，观察幼虫的发育情况及形态，培养36 h 后镜下观察并计数1 期（未蜕皮的幼虫）及2~4 期幼虫数（蜕皮1 次及1 次以上的幼虫）。设感染旋毛虫小鼠血清和正常鼠血清为对照组。
　　
　　2.6 间接荧光抗体试验对幼虫蜕皮情况的观察
　　收集方法 2.5 中培养36 h 的幼虫，采用试管法进行间接荧光抗体试验（IFAT）[9]，即将收集的幼虫置于1.5 ml 离心管中，加入1 ml 冷丙酮固定10 min；加入表面抗原免疫鼠血清（用0.01 mol/L pH 8.0 的PBS 1：10 稀释），37 ℃孵育30 min、PBS 洗涤3 次；加入用0.01mol/L pH 8.0 的PBS 1：30 稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG，并加入0.01%的伊文思蓝，37 ℃孵育30 min、PBS 洗涤3 次；将幼虫转移至载玻片上，滴加一滴缓冲甘油，盖上盖玻片在荧光显微镜下观察。蜕皮的幼虫无绿色荧光或仅有微弱的荧光，未蜕皮幼虫显示明亮的绿色荧光，分别计数1 期及2~4 期幼虫数。设旋毛虫感染小鼠阳性血清对照、正常小鼠血清阴性对照和PBS 空白对照。
　　
　　2.7 统计学分析
　　采用 SPSS16.0 对实验数据进行处理，旋毛虫幼虫数用均数±标准差表示。应用卡方检验对数据进行分析。
　　
　　3 结果
　　
　　3.1 幼虫在肠上皮细胞单层中的发育情况
　　培养 12 h 时旋毛虫幼虫已侵入HCT-8 细胞单层并在其中移行；18 h 在幼虫尾端可见鞘的形成，头端未发现帽样结构；24 h 可见幼虫部分蜕皮；36 h 幼虫蜕皮1 次；72 h 可见幼虫第2 次蜕皮；96 h 可见到早期成虫，在雄成虫尾端能够看到交配附器。
　　
　　3.2 免疫血清对幼虫侵入肠上皮细胞的影响
　　旋毛虫幼虫在含ES 抗原或表面抗原免疫血清的半固体培养基+HCT-8 细胞培养15 min后，发现ES 免疫血清组的部分幼虫头端有帽样结构形成，旋毛虫感染小鼠血清对照组部分幼虫头端也有帽样结构；帽样结构与幼虫头端紧密相连。表面抗原免疫血清组、正常小鼠血清对照组的幼虫均未观察到帽样结构。少数带有头端帽样结构的幼虫可移行到细胞单层表面，多数仍停留在半固体培养基中，但均不能侵入HCT-8 细胞单层中。培养12 h~36h 时可见虫体的尾端或者头端脱鞘，但虫体不能从鞘中脱出。
　　
　　3.3 免疫血清对幼虫发育的影响
　　由于旋毛虫幼虫表面抗原具有期特异性，蜕皮的幼虫无绿色荧光或仅有微弱的荧光，未蜕皮幼虫则显示明亮的绿色荧光。幼虫在含4 种血清的半固体培养基+HCT-8 细胞中发育至2~4 期幼虫百分比的差异有统计学意义（χ2=178.3，P<0.05），在含旋毛虫感染鼠血清、ES 抗原及表面抗原免疫鼠血清条件下发育至2-4 期幼虫的百分比分别为1.17%、2.25%、2.2%，均低于含正常鼠血清条件下24.74%的百分比（χ12=77.6，χ22=74.6，χ32=66.9，P<0.05），但在感染鼠血清、ES 抗原及表面抗原免疫鼠血清条件下发育至2-4 期幼虫百分比的差异无统计学意义（χ2=2.14，P>0.05）。
　　
　　4 讨论
　　
　　人结直肠癌细胞系-8（human coloniccarcinoma cell line-8，HCT-8），也称为人回肓肠上皮细胞系-8（human ileocecal epithelial cell line-8），培养成熟的HCT-8 细胞形态和功能与小肠上皮细胞类似，国内外主要用于药物吸收、结肠癌耐药机制等研究。近年来有人将HCT-8细胞成功地用于肠道内寄生原虫-隐孢子虫的体外培养[10-11]及抗隐孢子虫药物的体外筛选[12]。本文模拟旋毛虫感染宿主后的肠道内环境，观察旋毛虫幼虫在HCT-8 细胞中的发育情况,结果表明HCT-8 细胞能够维持旋毛虫幼虫在体外的发育，可作为体外研究旋毛虫侵入机制及筛选抗旋毛虫药物的细胞系。
　　感染性幼虫在含感染鼠血清或ES 抗原免疫血清的培养基中培养15 min 后，发现部分幼虫头端有帽样结构形成，表明幼虫头端的帽样结构是由幼虫口孔分泌的ES 抗原与感染血清或ES 抗原免疫血清中的抗体形成的免疫复合物，提示旋毛虫ES 抗原中可能存在有幼虫侵入肠上皮细胞的相关因子。由于旋毛虫感染性幼虫的口孔无齿状和矛状结构，幼虫并不能侵入所有的细胞系（如人肺成纤维细胞WI-38、小鼠横纹肌成肌细胞C2C12 及大鼠空肠隐窝细胞IEC-6 等）[8]，故幼虫对肠上皮细胞的侵入可能不是简单的机械性损伤，而可能是通过幼虫分泌的某种蛋白或宿主细胞释放的某些化学信号介导的[13]。本研究观察到的带有头端帽样结构的幼虫不能侵入到细胞单层中，表明幼虫头端的帽样结构可阻止幼虫对肠上皮细胞的侵入，其机制可能与帽样结构阻止了幼虫感觉器官对细胞信号的接收有关[14]。McVay[15]等将针对旋毛虫幼虫表面与分泌蛋白中泰威糖（tyvesole）抗原的单抗加入培养的犬肾上皮细胞MDCK-AA7 中，发现高浓度的单抗可完全阻止幼虫对上皮细胞的侵入，而低浓度的单抗虽然不能阻止幼虫的侵入，但可将幼虫包裹在细胞单层中，阻止幼虫的移行与蜕皮[16]。本研究将ES 抗原及表面抗原免疫血清按1：10 加入半固体培养基+HCT-8 细胞培养36 h，发现发育至2-4 期幼虫的百分比（2.25%及2.2%）均明显低于含正常鼠血清条件下培养的幼虫（24.74%），表明两种免疫血清均可阻止部分幼虫的蜕皮及发育。

　　
　　[参考文献] (略)
　　

上一篇：纺织品抗菌功能测试方法研究

下一篇：半固体制剂微生物限度检查法的体会