瘤胃内分解纤维素细菌的分离与鉴定

纤维素是自然界中最丰富的可再生自然资源，它的降解是自然界碳素循环的中心环节。我国的纤维素资源极为丰富,每年农作物秸杆的产量达到5.7×108 t，约相当于我国北方草原年打草量的50倍。目前这部分资源尚未得到充分的开发和利用。瘤胃纤维分解菌可分泌纤维素酶来有效的降解纤维素，因此瘤胃纤维分解菌的研究具有极其重大的现实意义和光明的发展前景。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 样品采集和处理
采集羊全瘤胃液,过滤后将处理的瘤胃液加抗生素（1 600单位/ml的青霉素，2 000单位/ml的链霉素）24 h后，抽取处理瘤胃液注入到滤纸培养基中，待滤纸崩溃后再将上清液抽取净，后用纤维二糖液体培养基将溃烂的滤纸洗涤，将洗涤液再次注入滤纸培养基中，待滤纸溃烂。 
1.1.2  滤纸处理
按蔡燕飞（2005）的方法进行处理[1]。
1.1.3 培养基
1.1.3.1 分离用主要培养基[2]
①纤维二糖液体培养基Ⅰ：NaHCO3 5.0 g/l,蛋白胨 1.0 g/l,纤维二糖 1.0 g/l,酵母浸膏 1.0 g/l, 磷酸缓冲A液165 ml/l，磷酸缓冲B液165ml/l，无细胞瘤胃液170 ml/l，蒸馏水 500 ml/l，0.1%刃天青1 ml/l，L-半胱氨酸盐酸盐 1.5 g/l。②纤维二糖固体培养基Ⅱ：即纤维二糖液体培养基Ⅰ中加入18 g/l的琼脂。③滤纸培养基（g/l）：即将纤维二糖液体培养基Ⅰ中的纤维二糖去除，然后加入处理后的滤纸。
1.1.3.2 鉴定用主要培养基[4]
①淀粉琼脂培养基：即将纤维二糖固体培养基Ⅱ中的纤维二糖去除，然后加入淀粉1.0 g/l。②半固体培养基：即将纤维二糖固体培养基Ⅱ中琼脂量减为8 g/l。③糖或醇类发酵实验培养基:蛋白胨 20 g/l，琼脂15 g/l，氯化钠 5 g/l,蒸馏水 1 000 ml/l，硫乙醇酸钠1 g/l,1.6%溴甲酚紫 1 ml/l, 碳源 10 g/l，在本实验中碳源为葡萄糖、果糖、山梨醇、甘露醇、半乳糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖、阿拉伯糖、菊糖、鼠李糖、卫茅醇。④石蕊牛奶试验培养基：新鲜脱脂乳 100 ml/l,石蕊酒精溶液 1 ml/l(或溴甲酚紫溶液0.1 ml/l)。⑤醋酸铅琼脂培养基：1.5%肉汤琼脂 5 g/l,10%醋酸铅溶液 3 ml/l,10% 硫代硫酸钠溶液（新配制的）2.5 ml/l。⑥明胶液化试验培养基：明胶 15 g/l,普通肉汤 100 ml/l。 
1. 2 实验方法
用无菌注射器将滤纸溃烂的培养基的上清液缓慢抽出弃掉，在剩余的滤纸沉淀物中注入新鲜的纤维二糖液体培养基，摇动10 min，将滤纸上吸附的菌洗脱。
在厌氧操作箱中，将菌液洗脱液倍比稀释，然后进行倾注培养。将其直接置入厌氧操作箱中39 ℃的厌氧培养箱内，连续培养36 h。待长出菌落后，用无菌牙签在厌氧操作箱中挑取平皿中单个典型菌落，进行筛选，直至菌落单一典型，然后移入纤维二糖液体培养基中进行富集。最后用鉴定培养基进行鉴定。
2 实验结果与分析
从绵羊的瘤胃中共分离出6株分解纤维素的细菌，对其中的4株菌株进行鉴定。
2.1 形态学观察
细菌H1：表面观察，菌落是凸起、边缘整齐、有规则的圆形，镜下同心环状，不透明，奶油白色，中间微黄，有光泽，粘稠，2～3 mm的中等大菌落。革兰氏染色为阳性呈棒状，菌体两端稍尖，单个散在。
细菌H2：从培养基深层观察，菌落是有规则的圆形，边缘整齐；从培养基上部观察，菌落呈双凸镜状，黄色，2～3 mm中等大小菌落。革兰氏染色为阳性球菌，成对或8个以上的长链组成。
细菌H3：在培养基的底部，菌落边缘整齐，不规则，光下观察，有荧光，灰白色，呈玻璃雾状，菌落部位有气泡，4～6 mm的大菌落。革兰氏染色为阳性球菌，成对或短链组成，菌体两端钝园。
2.2 其它结果
2.2.1 纤维二糖培养基（无缓冲液）中最终pH值的鉴定结果
在纤维二糖培养基(无缓冲液)中的最终pH值平均为5.5。实验结果显示,实验菌株发酵纤维二糖产酸。2.2.2 观察菌体有无气体产生的鉴定 
细菌H3的菌落底部有气泡。结果显示，实验菌株H3产生气体。
2.2.3 生长特性的观察
在纤维二糖液体培养基中一天内混浊，底部有白色细腻状沉淀。3 d后，溶液变清，颜色由黄变红，底部有大量絮状沉淀。
2.2.4 对氧的需求
在厌氧罐中，培养基上培养的细菌无菌落生长；在厌氧培养箱中，培养基上培养的细菌有菌落生长。 实验结果显示，实验菌株严格厌氧。
2.3 生化鉴定结果[3]（见表1、表2）
 
实验菌株H2、H3在糖或醇发酵实验中均为阴性，表明不利用或很少利用碳水化合物。实验菌株H1在糖或醇发酵实验中大部分均为阳性，表明利用或微弱利用碳水化合物。
2.3 讨论
本实验通过对细菌菌体及菌落的形态、大小、颜色的形态学观察以及细菌其它特性和生化结果的测定,来判定细菌的种属。按照1986版的《伯杰细菌鉴定手册》（5）和《伯杰细菌鉴定手册》第八版所示的白色瘤胃球菌的特征及特性[3]，初步鉴定实验菌株H1为产纤维二糖梭菌；H2为黄色瘤胃球菌；H3为白色瘤胃球菌。
参考文献
[1] 蔡燕飞, 李华兴. 纤维素分解菌的筛选及鉴定[J].林产化学与工业，2005,25（2）：67-70.
[2] Hobson P N. Rumen bacteria, In J. R. Norris et al. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 3B. Academic Press, Inc. (London), Ltd., London. 1969:133-149. 
[3] R．E．布坎南, N．E.吉本斯. 伯吉细菌鉴定手册[M]. 科学技术出版社，1981:725-727. 
[4] 东秀珠，蔡妙英，等.常见细菌系统鉴定手册[M].科学出版社，2001:370-399.

 

上一篇：半固体制剂微生物限度检查法的体会

下一篇：一种评价光合细菌调水作用的实验方法探讨