一种评价光合细菌调水作用的实验方法探讨

光合细菌（photosynthetic bacteria,简称PSB）是一群能在厌氧光照或好氧黑暗条件下，利用有机物作供氧体和碳源进行不放氧光合作用细菌的总称。光合细菌能有效利用水体中过剩的有机物作为自身繁殖的营养源，间接增加溶氧，稳定水质，可作为水产养殖水质净化剂，因而一直得到广泛关注。因为光合细菌种类多，不同养殖水体条件差异较大，加上野外条件下的影响因素十分复杂，有关光合细菌产品在实际养殖水体中的应用效果评价一直存在很大难度。
光合细菌对养殖水体的调节作用主要是影响水体的浮游生物，特别是藻类的生长作用，因而会影响到水体的初级生产力。黑白瓶测氧法是水域生态学中评价水体生产力的一种常用技术方法。本文通过分析利用传统的黑白瓶测氧法评价光合细菌调水作用实验方法的可行性，以期获得实验室条件下评价光合细菌调水作用的简易方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 材料与试剂
2.5 L玻璃采水器1个，250 ml白瓶25个，挂瓶架4台；溶解氧滴定所用设备及药品参照GB 7489—87。
1.1.2 光合细菌菌种
由广东海大集团股份有限公司畜牧水产研究中心微生物实验室筛选提供,经鉴定为沼泽红假单胞菌。
1.1.3 水样
采自广州市番禺区城郊一人工养殖池塘，水体透明度为20 cm左右。
1.2 实验方法
于2008年3～8月间,分别进行黑白瓶测氧法试验。
1.2.1 水样采集
在所选池塘采集约50 cm深度的水样后，小心将水样注入水样瓶。作初始氧量测定用的水样瓶应立即固定，待加入光合细菌的瓶应置于阴凉处，避免日光直射。
1.2.2 光合细菌的加入
将试验用光合细菌制剂以生理盐水适当稀释后，再按最终浓度要求（10、100 mg/l）吸取稀释液到水样瓶中，灌瓶后轻轻搅匀，每个样品设置3次重复。
1.2.3 水样光照培养
灌瓶后的黑白瓶在室温下进行自然光照培养处理，瓶与瓶的间距以互不遮光为原则，光照培养过程中，每隔30 min轻摇瓶体以使瓶内水体均质。
1.2.4 灭活光合细菌溶液的准备
将相应浓度的光合细菌溶液在80 ℃水浴条件下进行灭菌15 min后，冷却使用。
1.2.5 水样的固定及溶解氧的测定
分别进行了1、3、5、6和7 h的光照培养时间后，立刻进行黑白瓶水样的溶解氧测定，具体方法参照GB 7489—87。
2 结果与分析
2.1 光照培养时间对测定方法的影响
试验考察了不同光照时间1、3、5、6和7 h对添加10 mg/l光合细菌组溶氧（DO）值的影响情况，具体情况如图1所示。从图1可以看出，加菌组与对照组的起始DO值相差不大，经1 h光照处理后，加菌组的DO增加幅度明显比对照组的大；而光照培养3 h后，对照组与加菌组的DO值相近；但光照培养超过5 h后，加菌组的DO值则明显低于对照组。
 
由此可知,添加光合细菌到水样中对于水体产氧,即初级生产力确有一定影响,具体表现为：培养时间较短,低于3 h时,水体产氧有所增加;而超过3 h后,光合细菌添加组溶氧量降低。值得提出的是,当光照培养时间超过6 h后,如达7 h时,水体产氧变化幅度不再增加,如图1。因此说,本实验评价方法至少需要光照培养3 h以上;考虑到实验组与对照组的差异,实际进行实验时应当选择光照培养时间为6 h左右为宜。
2.2 光合细菌浓度对实验评价方法的影响（见图2）
 
图2所示为以光照培养时间为6 h时的光合细菌浓度对实验评价方法的影响。从图2可以看出，光照培养6 h时，各水体DO值达14 mg/l以上；光照培养时间不超过6 h，对照组DO增加值为12.97 mg/l，光合细菌添加量为10 mg/l的加菌组DO增加值为11.98 mg/l，大于光合细菌添加量为100 mg/l的加菌组DO增加值10.10 mg/l；2组不同浓度的加菌组DO值增幅均较对照组的小，即添加光合细菌后水体产氧能力均会下降。
2.3 灭活光合细菌对实验方法的影响
因光合细菌使用时与培养基伴随存在，故有必要探讨光合细菌培养基成分对实验评价方法的影响。图3所示为直接添加了灭活光合细菌产品的实验情况，可以看出,添加灭活光合细菌10 mg/l及100 mg/l的实验组与对照组的溶氧值增幅相近,如对照组DO增加值为11.12 mg/l,而加菌组增加值为11.34 mg/l，相差0.22 mg/l。由此可见，添加灭活光合细菌产品对水样DO值影响极小，即光合细菌培养基对实验方法的影响可以忽略不计，只考虑光合细菌本身的作用。
2.4 不同光合细菌调水效果的评价
应用本方法分别比较了光合细菌A（荚膜红光合细菌）、光合细菌B（沼泽红假单胞菌）和光合细菌C（市场采样）这3种不同光合细菌产品调水作用情况，结果如图4所示。由图4可以看出，不同加菌组的产氧变化斜率均小于对照组，即不同加菌组DO值的增加幅度都比对照组小，这进一步验证了添加光合细菌产品后会降低水体DO值的情况；而不同加菌组DO值的增加幅度会有所不同，在6 h时菌C的溶氧量最低，菌A较高，菌B最高，说明不同的光合细菌调水作用效果确实存在一定差异，这说明菌C的调水作用相对最大，菌A次之，菌B相对影响较小。
 
 
3 讨论
由于光合细菌等微生态制剂在实际养殖水体中的调水作用最终会表现为水体溶解氧水平的变化，因此，从理论上讲，采用黑白瓶测氧法应该能够定性反映出光合细菌等微生态制剂产品调水作用的大小。就此而言，建立实验室条件下评价光合细菌等微生态制剂调水作用效果的有效方法是可行的。本实验主要采集透明度不低于20 cm的养殖池塘水体，分别考察了光照培养时间、光合细菌添加量（10和100 mg/l）及光合细菌产品灭活后对于黑白瓶实验评价方法的影响情况。
3.1 关于光照培养时间
就光照培养时间而言，添加光合细菌处理后养殖池塘水体溶解氧值总体表现出下降趋势，这可能是因为光合细菌兼性营养生长所致，即在自然光照条件下，光合细菌基本适应环境后会与水中藻类竞争营养盐，从而造成藻类的光合作用一定程度下降，则表现出水体溶解氧水平下降的现象。这与李长慧报告中指出多个在水池水质净化中的试验都表明了光合细菌具有类似作用结果一致。实验中表现出的光照培养3 h前，水体溶解氧水平上升，可能是光合细菌处理后，其中的营养盐对于藻类有一定的刺激作用，使得藻类光合作用强度短暂增加。而超过6 h以后，光照培养时间过长，光合细菌生长受到一定程度的抑制，则对于藻类光合作用的影响减弱。因此说，光照培养时间的选择对于实验评价方法十分关键。后期不断重复的实验结果也表现出，6 h的光照培养时间下，光合细菌的影响作用表现相对比较稳定。
3.2 关于光合细菌的添加浓度
良好实验评价方法的灵敏度情况十分重要。就本方法而言，光合细菌的添加浓度对于实验结果表现十分重要。尽管实际养殖生产中，光合细菌的施用浓度一般在1~2 mg/l左右，这主要是基于使用成本考虑。而本研究前期进行的预备实验中，采用1 mg/l的光合细菌添加实验得出的结果与对照组相比差异不显著。另一方面，本实验同期正在进行的大塘养殖实验表明，光合细菌添加量必须加大，其效果才比较显著，因此本试验选择10和100 mg/l两个浓度考察对于实验方法的影响情况。相比较而言，100 mg/l的影响作用更大，但考虑到光合细菌添加浓度太大，与实际使用情况相差较远，应用成本太高，且对于水体营养盐成分改变较大，所以本实验选择光合细菌添加量以10 mg/l为宜。
黑白瓶测氧法是评价光合细菌调水作用效果的理论基础，应用碘量法测定水体溶解氧还必须考虑实际溶解氧浓度的影响，即水样中的溶解氧水平要在0.2 mg/l和溶解氧饱和浓度的2倍（约20 mg/l）之间，否则必然会影响到实验评价结果。这些也限制了光照培养时间或光合细菌的添加浓度等。实际实验中，如果采用的水样藻类过浓，则水样必须进行稀释后，使透明度为20 cm左右才行。
3.3 关于溶解氧测定方法
值得提出的是，当光照培养时间过长或水体过肥，或光合细菌添加量太大时，培养水体的溶解氧水平过高，则必须考虑到溶解氧测定步骤中后期酸化水样中加酸量对测定结果的影响。实际考察了溶解氧含量过高（超过15 mg/l以上）时，加酸量对于溶解氧测定值的影响情况，如图5所示。可以看出，随着加酸量的增加，水样中的溶氧量测定值逐渐增加，直至趋于稳定。这也说明，只有加酸量达到一定量后，所测定水样中的溶解氧测定值才会达到稳定。因此，实际操作中其加酸量不能太少。但加酸量过大时会影响水样原体积，从而影响实验结果。
 
3.4 其它影响因素
最后，光照强度也是本实验方法必须考虑的重要因素。当光强度过低时，如阴雨天气会导致实验效果不明显。另外，水样中含有氧化性物质或悬浮物及较多亚硝酸盐氮和亚铁离子等都是碘量法测氧本身的缺陷，这些对于本实验方法当然会有一定影响。
初步基于以上几种因素建立的本实验方法，进行市场上几种调水用光合细菌的效果评价。结果得出，以透明度不低于20 cm的养殖用水，在光照培养时间为6 h，光合细菌添加浓度为10 mg/l的实验条件下，添加光合细菌会使得水体溶解氧水平降低10%~15%左右。就光合细菌A、B和C 3种产品而言，产品C使得溶解氧水平下降幅度最大，达15%左右，则实际应用中，可作为有限考虑使用的产品。
4 结论
本研究表明，在一定条件下本实验方法可以作为评价微生态制剂改良水质的有效依据。与现有评价方法相比，本实验方法简单、过程操作可行，可作为调水用光合细菌产品研发公司菌种筛选提供一种简便的实验室评价方法。

 

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