变形链球菌耐氟菌株脱矿能力的体外研究

摘　要：目的：探讨耐氟突变后，其致釉质片脱矿能力的改变。方法：采用原子吸收分光光度计，测定不同氟浓度条件下耐氟菌株培养物上清液中钙离子浓度，并与亲代菌株进行比较。结果：耐氟菌株在无氟化物存在时，小于亲代菌株；而当0.5mmol/L氟离子存在情况下，其大于亲代菌株。差异具显著性。结论：耐氟菌株的产生将增加的致龋力。
(以下简称变链菌)为人类龋齿主要致病菌，其高致龋力与自身具有很强的产酸力和脱矿力有关。局部高浓度氟化物的广泛应用可导致变链菌耐氟菌株的产生。国外学者已在体内及体外获得变链菌耐氟菌株，并对其致龋毒力进行研究［1，2］。为探讨国人变链菌耐氟菌株脱矿能力的改变，本实验在体外通过测定变链菌耐氟菌株及亲代菌株致釉质，以推测其致龋能力的改变。
1　材料和方法
1.1　细菌和培养基
变链菌亲代野生菌株为国际参考株S.mutans Ingbritt和本实验室临床分离株SSMU-M1；耐氟菌株为上述亲代菌株体外经逐步诱导法获得［3］，分别命名为Ingbritt-FR和M1-FR。
培养基为含40g/L葡萄糖的乳酪消化大豆胨肉汤TSB。
1.2　菌悬液及培养基配制
按常规将4种待测菌株活化后，于TSB培养基中37℃微需氧培养18h。离心收集细菌。生理盐水调吸光度ABS为1.0，备用。
在含40g/L葡萄糖TSB培养基中加入20g/L NaF液使终度分别为0、0.05和0.5mmol/L，用以细菌脱矿实验。
1.3　釉质片的制作
选择临床上因正畸需要而拔除的上颌前磨牙，体视显微镜下观察无龋，无裂痕，无斑釉症及四环素牙等疾患。彻底洗刷干净，切去牙根，取冠部釉质冷水冲洗下磨制成4mm×4mm×1mm大小釉质片，超声清洗5min，750ml/L乙醇消毒72h，备用。
1.4　细菌脱矿实验
将消毒好的釉质片用无菌生理盐水冲洗3次后，置于含有不同氟浓度的TSB培养基中，每个试管置4片，再按菌液：培养基为1：10(v/v)比例接种细菌，37℃微需氧培养72h(950ml/L N2，50ml/L CO2)。以不接种细菌但含有釉质片的TSB培养基作阴性对照。
1.5　培养基中钙、磷浓度测定
将含有釉质片的72h细菌培养物，经3?000r/min离心15min，取2ml上清液，用2g/L LaCl3溶液稀释后，在原子吸收分光光度计(VIDEO22型，美国实验仪器公司)上，以灯电流5mA，波长422.7nm，狭缝宽度1.0nm以下，用火焰原子吸收法进行检测。
2　结果
各菌株在不同氟离子浓度下对釉质片的脱矿情况(表1)。
表1　变链菌及耐氟菌株在不同氟浓度下的 (n=4) （略）
 
△表示耐氟菌株； 与亲代菌株相比， *P<0.05，
**P<0.01，有显著性差异经Student t检验：F=0mmol/L时，亲代菌株Ingbritt和SSMU-M1致釉质脱出的钙、磷离子量多于耐氟菌株Ingbritt-FR 和M1-FR(P<0.05)；F=0.05mmol/L(相当于2mg/L)时，二者相近；F=0.5mmol/L时，耐氟菌株大于亲代菌株(P<0.05)。临床分离株与国际参考株表现相同(表1)。
3　讨论
釉质内含有大量无机物，按重量计算占95%，其中绝大部分为含有磷酸钙的羟基磷灰石晶体。所以，釉质中含有最多的无机组份是钙，其次为磷，钙与磷呈平行分布，且釉质内Ca/P比值保持恒定，一般为1.60±0.08。龋齿是由于菌斑细菌酵解碳水化合物产生酸，酸积累达到一定数量和时间，牙齿中的矿物质发生溶解，钙和磷等无机离子由牙齿中脱出，发生脱矿而开始。
本实验发现，变链菌亲代菌株和耐氟菌株产生的乳酸量皆可导致釉质片脱矿。在无氟条件下，很大，最大钙离子浓度为161.91mg/L(SSMU-M1)。氟的加入，可减少钙和磷的溶出量，至0.5mmol/L氟离子浓度时，有大幅度下降，但仍有部分钙磷溶出，且钙与磷的溶出量基本呈平行关系。本实验室所做的产酸实验发现，变链菌亲代株及耐氟株皆可使培养基终末pH值降至4.0左右，且在0.5mmol/L氟离子浓度下，仍可使pH值降至5.0以下。虽然细菌产酸使环境pH值降低的数值在有无釉质存在下是不同的［3］，但该结果仍可说明耐氟菌株产酸量与相吻合，即有无氟化物存在，耐氟菌皆可导致釉质片的脱矿。表明耐氟菌株具有致龋潜力。这与van Loveren等学者的研究结果相吻合［4］。
从表1还可看出，无氟条件下，亲代菌株Ingbritt和SSMU-M1的大于相应耐氟菌株Ingbritt-FR和M1-FR，这与pH7.0时两种菌株产酸能力相符。实验中还发现：在低浓度氟离子0.05mmol/L存在时，亲代菌株与耐氟菌株钙磷溶出量无显著性差异。当釉质存在时，氟化物有两方面作用：一是降低细菌产酸量，二是减慢釉质溶解速度。这两个作用对环境pH值可产生相反影响。产酸的抑制可升高终末pH值，而降低牙釉质的溶解速度，因为减少了由于釉质溶解而产生的缓冲作用，最终导致pH值的下降。研究发现，在0.5mmol/L 氟离子浓度时，氟化物抑制变链菌C180-2的产酸作用要占总作用的75%，而0.05mmol/L氟离子浓度时，氟对细菌产酸和釉质脱矿的两个作用达到平衡，终末pH值无变化［5］。本实验结果显示，0.05mmol/L氟离子浓度时，细菌脱矿受到抑制，但耐氟菌株与亲代菌株钙、磷离子释出量无明显差异；而0.5mmol/L氟离子浓度时，细菌产酸脱矿过程受到明显抑制，上清液中钙、磷离子浓度明显下降。但耐氟菌株受抑制程度较轻，其明显大于亲代菌株。说明氟化物的存在，特别是0.5mmol/L左右氟化物的存在，不能很好抑制耐氟菌株的生长和代谢。
牙菌斑有吸收氟和蓄积氟的能力，正常情况下菌斑氟离子浓度为0.5mmol/L左右［5］。该结果提示，在正常菌斑氟离子浓度条件下，耐氟菌株的致龋潜力将大于亲代变链菌株。说明氟化物的应用存在一定局限性。在临床防龋过程中，应寻找其它药物与之联合使用，以达到同样甚至更好的防龋效果，而又可防止耐氟现象的发生

 

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