分支杆菌药物敏感性测定的几个问题医学文献

非结核分支杆菌病的治疗和药物敏感性测定最初是模仿结核病的治疗和结核分支杆菌药敏试验。但是,非结核分支杆菌在药物敏感性方面存在一些自己的特征。因此, 与结核分支杆菌药敏试验方法有所不同。目前对分支杆菌药物敏感性研究尚欠深入,对其规律性认识不清， 结果不令人满意。

　　一、分支杆菌药物敏感性特征

　　就其对药物敏感性而言, 非结核分支杆菌存在三个特点:(1)药物敏感度幅度大,分布散。 结核分支杆菌野生株对利福平、 异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、 氧氟沙星等的最低抑菌浓度（MIC）范围相差仅 2～4倍,而鸟分支杆菌野生株对上述药物的MIC范围则有十数倍至百倍之多。这样的结果,仅仅是从肺部感染和人类免疫缺陷病毒（HIV）的播散性感染患者分离株的测定结果。如果包括环境或无明显症状者仅仅是栖居的痰中分离株MIC的范围可能更广^{［1, 2］}。 和MIC一样，最低杀菌浓度（MBC）也显示同样的特征，幅度大,分布散。 氧氟杀星和环丙杀星对鸟分支杆菌的MBC/MIC比值在1～8, 而结核分支杆菌仅为0.5～2。一些抑菌和杀菌定量指标分布散的特点，也反映在鸟分支杆菌的琼脂固体培养基和液体培养基上，测定结果相差远较结核分支杆菌大。在7H10琼脂培养基和7H12液体培养基测定的结核分支杆菌对异烟肼、乙硫异烟胺、 利福平、链霉素、 卷曲霉素、乙胺丁醇等MIC 基本相同。 但是,在两个培养基上测定的对鸟分支杆菌的MIC相差2～16倍之多。(2)大多数抗结核药物对鸟分支杆菌等的活性很低。(3) 即使是有效药物,大多数也显示很弱的杀菌能力, 并显示了株的差异性。这是因为它们有高MBC/MIC比值和MBC浓度往往超过血清峰值（Cmax)的缘故。 利福平对鸟分支杆菌野生株的MBC/MIC在4～64(pH6.8)和4～128(pH5.0), 显示了株的差异。 600 mg口服利福平的最高血清浓度仅在8～12 μg/ml。

　　因此, 株依赖性和低敏感性成为包括鸟分支杆菌在内的分支杆菌药物敏感性的特征。显然，非结核分支杆菌的药物敏感性测定不能套用结核分支杆菌的临界浓度, 采取测定其敏感性程度的定量方法就成为唯一的正确选择。

　　同时, 由于大多数药物显示很弱的对非结核分支杆菌的杀菌活性, 采用药物联合用药是必然的。研究发现, 在联合用药效应上,非结核分支杆菌同样显示株间的差异。 因此,对于非结核分支杆菌来说, 药物间的并用效应是株的特征, 而非药物的属性, 因此, 需要个体化测定联合用药的效应。

　　二、药物协同作用的定量测定

　　采用联合用药一般是为了(1)减少出现耐药性的可能性。(2) 增加边缘效应药物的抗菌活性, 特别是免疫无反应患者所需的杀菌活性。(3)降低用药剂量, 减少毒性。(4)扩大治疗范围。(5)治疗同时出现的多种感染。

　　联合用药是结核病化疗最重要的原则, 其主要目的是为了(1)降低耐药性出现频率。(2)用于起始耐药率高的地区。(3) 设计合理的短程化疗。在结核病短程化疗联合用药中,利用不同药物对结核患者体内不同环境和不同代谢状态异质性的菌群的各自作用设计联合用药是一个重要考虑。而在鸟分支杆菌等非结核分支杆菌治疗中采用联合用药的目的有所不同,主要是利用药物杀菌活性的相加或协同, 以克服“自然”耐药性。因此,进行野生株的联合用药并用效应的个体化测定是必要的。

　　并用药物测定的程序如下: 首先测定临床分离株的单药MIC， 对于高于“敏感” 切点的株,再进行2药或多药的并用效果测定。 其采用的药物浓度应该是1/2, 1/4,1/8 MIC的单药药物浓度。 BACTEC法测定结果判定的标准是评估并用瓶内生长指数(GI)和单药瓶内GI的商。此商值和并用药物数的倒数相比较(1/并用药物数)，两药并用时商值＜0.5, 可视作两药有协同作用；等于1时, 为相加；≥2时，为拮抗。

　　三、药物后效应(PAE)

　　药物的另一个抗菌活性是PAE。PAE是药物短时间脉冲式作用后,除去药物后发现细菌再生长或持续抑制的时间(天)。一般是将活菌数10倍增加作为再生长的指标，在结核分支杆菌中称为生长延迟。PAE反映非致死性损伤, 是一介乎MIC和MBC之间的活性。机制不清, 可能(1) 药物在细胞作用部位有限的滞留或(2)亚致死性损伤。在PAE期间, 增加了对其他药物的脆弱性。但在测定PAE时, 应注意菌活性 和PAE。因此,一般采用Cmax和Cmax保持的时间测定PAE。结核分支杆菌的生长延迟, 成为短程化疗的一个依据。但是PAE在非结核分支杆菌中作用的有关资料很少,仍待研究。

　　四、定量测定

　　由于从未接触药物的结核患者的分离株对药物敏感性程度相近,并远离Cmax。因此, 可采用一临界药物浓度测定野生株的敏感性或耐药性。 临床实验室常规采用的绝对浓度法, 1%比例法均采用临界药物浓度法。但是, 鸟分支杆菌等非结核分支杆菌敏感性离散程度高, 有株依赖性。因此, 个体化定量测定其株的敏感性程度是唯一可能的选择。 这些定量指标主要是单个药物和并用药物的MIC和MBC测定。MIC是在一定培养时间内可抑制 99%以上的菌生长的最低药物浓度。测定中, 需要注意药物失活和降解, 以期得到可信的数值。因此, 应慎用培养基和限定培养时间。美国国家实验室标准委员会(NCCLS)规定一般细菌的药敏测定时间是24～48 h, 缓慢生长分支杆菌是2周(7H10 琼脂培养基)、8 d(7H12液体培养基), 快速生长分支杆菌为4 d。而结核分支杆菌是 3 周(7H10)和8天(7H12)。

　　另一个定量指标是MBC,是在24 h培养期间杀死99.9%接种菌群的最低药物浓度。抑制商(IQ)( 平均Cmax/ 患者分离株)和强度指数(ID)(＞MIC的平均血清浓度/ 患者分离株MIC)是考核药物治疗的可能结果的另外两个定量指标。但是, 在方法上也存在不同作者对接种量、药物浓度和结果解释上的不同意见。因此, 在鸟分支杆菌复合群中, 何时何株需要进行药物敏感性测定仍有争议。

　　1．MIC测定：药物敏感性测定中必须关注的是在培养基制备和测定过程中药物的失活。在不同培养基中, 因为成分和制备过程中药物变化程度不同出现不同的MIC。如罗氏培养基测定的利福平的MIC是40 μg /ml, 而在 7H10琼脂培养基为1 μg /ml, 在7H12液体培养基中为0.25 μg /ml。缓慢生长分支杆菌可采用类似结核分支杆菌药物敏感性测定的固体法(琼脂、罗氏、小川培养基和7H10琼脂培养基)。由于在固体培养基中测定的MIC可能并非真正的药物浓度，因此,测定的MIC很难和血清峰值浓度及其他药代动力学指标比较。但是,可用于治疗期间患者菌群敏感性变化的监测。

　　理想的MIC测定采用液体培养基的方法, 因为它可较好满足药物敏感性测定对药物失活和时间的要求。因为 (1) 可1周内完成药敏测定(琼脂固体培养基需要2周)。(2) 药物吸附和降解最少。(3)加入的浓度可认作是实际作用浓度。(4)测定的MIC 可与Cmax和其他药代动力学参数比较。(5) 可测定MBC,得到MBC/MIC比值。液体培养基中测定MIC的方法有集落形成单位（CFU）计数法, 浊度法和BACTEC法。7H12 培养基中CFU计数法,是最精确的方法，是其它方法的对照标准。但费时费事, 不能推荐为临床实验室方法。结核分支杆菌由于呈簇状生长,干扰了浊度测定的精确度。大多数非结核分支杆菌如鸟分支杆菌和胞内分支杆菌培养物在培养液中呈散开的生长, 适用于浊度法。 但是, 为了能在1周内获得结果, 采用了大菌量接种。BACTEC辐射测定的基础是放射测定的抗结核药物结果和CFU测定结果一致。方法简单,但费用高。BACTEC的MIC测定是以生长指数(GI)低于100倍稀释对照管的最低药物浓度^［4］。

　　在BACTEC系统中,结核分支杆菌药敏试验中敏感/耐药的临界浓度是以未接触过药物的野生株最高MIC值确定的。临界浓度法节省时间、费用，但不能检出仍对化疗反应良好的患者的中度敏感或中度耐药株的中间株。因此, 多切点浓度(一般是3个浓度)则可将临床分离株分成四类: 敏感( 其MIC 处于野生敏感株的范围内),中度敏感( 其MIC高于在敏感野生株中发现的范围, 但两倍低于文献中介绍的最低的Cmax), 耐药( 其MIC处于 Cmax水平)和非常耐药( 其 MIC 实质性高于Cmax)^［4］。由于化疗失败病例耐药性改变非常迅速,同时敏感株的敏感程度离散度小，因此,在结核分支杆菌中测定中间株可能并不十分重要。一个测验中,鸟分支杆菌对异烟肼的MIC₅₀为2.32 μg/ml, 而MIC₉₀则＞10 μg /ml。因此, 由于离散度大和株依赖性的原因, 采用某临界药物浓度判定鸟分支杆菌的敏感/耐药相当困难, 需要寻找别的敏感/耐药的标准。Isenberg 1988年提出一个假设: 患者分离株耐受性等于或高于Cmax株, 对化疗无反应，而患者分离株对低于Cmax浓度敏感、可能对化疗有反应，则成为敏感/耐药标准的基础。显然,在标准中需要同时考虑两个因素: 未接触过药物的野生株的最高MIC和血清 Cmax或组织浓度。

　　Heifets依据对药物的敏感程度也将鸟分支杆菌分为四类: 敏感(其 MIC处于结核分支杆菌切点浓度内), 中度敏感(其 MIC 明显低于Cmax,但在野生结核分支杆菌之上),中度耐药( MIC处于Cmax水平上)和高度耐药 (其MIC超过Cmax)。有关快速生长非结核分支杆菌如偶然分支杆菌、龟分支杆菌等的研究较少, Heifets等^［3］认为也应适用于鸟分支杆菌的划分原则。

　　2．MBC：对需氧菌而言,MBC是指作用18～24 h培养期间能杀死 99.9%菌群所需的最低药物浓度。这样的杀菌率实际上是一主观性指标。由于大多数药物对鸟分支杆菌等的杀菌活性低,测定MBC并与Cmax比较, 对于估价感染治疗结果尤其是免疫低下患者是重要的。MBC的测定只有在液体培养基以CFU计数进行。因此,临床实验室常难以进行。

　　3．抑制商和强度指数都有助于对化疗结果的预测。

　　五、药物敏感测定结果的解释

　　一般评价药物活性有下列途径: 试管内抑菌和杀菌活性测定,巨噬细胞内试管实验, 产生体内条件的试管内模型实验, 鼠实验性治疗和临床验证。 关于分支杆菌药物敏感性测定虽然已经积累了大量的资料, 但是临床验证较少。应该特别注意的是大多数临床验证是回顾性分析, 缺乏双盲试验验证。

　　美国胸科学会（ATS）在1997年提出了对一些非结核分支杆菌进行药物敏感性测定的药物名单及评价，详见表1。

表1　考虑可作非结核分支杆菌敏感性测定的药物(美国胸科学会,1997)

菌种 确认的

　　临床相关性 未确认的

　　临床相关性 无用的药物

　　敏感性测定 缓慢生长分支杆菌 　鸟分支杆菌复合群 甲红霉素^* 阿米卡星,环丙沙星，乙胺丁醇,乙硫异烟胺，利福布丁,利福平,链霉素 异烟肼，吡嗪酰胺 　堪萨斯分支杆菌 利福平 阿米卡星,环丙沙星，甲红霉素，乙胺丁醇 吡嗪酰胺 　瘰疬分支杆菌 链霉素，强力霉素或二甲胺四环素，

　　乙胺丁醇，利福平,磺胺类 阿米卡星,环丙沙星，甲红霉素,利福布丁 异烟肼,吡嗪酰胺　嗜血分支杆菌 甲红霉素^* 阿米卡星 吡嗪酰胺　玛尔摩分支杆菌 乙胺丁醇 环丙沙星 　猿猴分支杆菌 利福平 异烟肼 　斯氏分支杆菌 　 利福布丁 　蟾蜍分支杆菌 　 链霉素 快速生长分支杆菌 　 　脓肿分支杆菌阿米卡星 头孢美唑 氯苯酚嗪 　龟分支杆菌 头孢噻唑 亚胺青霉烯 乙胺丁醇 　偶然分支杆菌 环丙沙星 氧氟沙星 异烟肼 　产粘液分支杆菌 甲红霉素 托普霉素 吡嗪酰胺　耻垢分支杆菌 强力霉素或二甲胺四环素，磺胺类 　 利福平，链霉素

　　注：^*大环内酯类(甲红霉素,阿齐霉素,罗红霉素)　　药物敏感性测定是为了预期和评价放疗方案对非结核分支杆菌病治疗的疗效。 鉴于非结核分支杆菌药物反应特点, 应切实考虑Heifets等关于分支杆菌药物敏感性测定的双个体化, 同时考虑患者药代动力学和患者分离株的药效学定量测定^［4］。实际上, 由于有关非结核分支杆菌的临床治疗往往是回顾性分析, 缺乏前瞻性严格的双盲性临床试验研究, 特别是实验室的敏感或耐药测定结果和临床疗效的关系分析。因此, 我们期望任何非结核分支杆菌病的临床研究都应该包括药物敏感性测定和临床疗效关系的研究。

参考文献

　　1，Heifets LB, Iseman MD ，Lindholm-Levy PJ. Ethambutol MICs and MBCs for Mycobacterium avium complex and Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother，1986，30: 927-932.

　　2，Heifets LB, Lindholm-Levy PJ，Flory MA. Bactericidal activity in vitro of various rifamycins against M.avium and M.tuberculosis. Am Rev Respir Dis，1990，141：626-630.

　　3，Heifets LB. Drug susceptibility in the chemotherapy of mycobacterial infections. London: CRC Press，1991.131.

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