木霉菌的发酵条件研究

在医学和农业生产中木霉菌可以作抑制病害的生防菌，木霉菌的生长及发酵条件是工业化批量生产木霉菌的提在本文中，主要研究了不同碳源、氮源、碳氮比、钠镁盐、培养时间、温度及pH对发酵产量的影响。
　　1 材料与方法
    
　　1.1 木霉菌株的来源 经对峙培养及活体试验后有效的BTC21（Trichoderma.harzianum）菌株。    
　　1.2 不同碳源对BTC21菌丝生长及产孢的影响 基础培养基为:蔗糖20g，硝酸铵5g，磷酸钠2g，硫酸镁1g，蒸馏水1000ml。分别有葡萄糖、果糖等。15碳源与其中的蔗糖置换，以无碳源的做对照，配制成不同碳源的培养液，每瓶50ml，接种培养3天的d=6mm的BTC21菌片3片，在25℃下振荡培养（120rpm）。第8天测菌丝干重并观察孢子产生情况，每处理重复3次。    
　　1.3 不同氮源对BTCZI菌丝生长及产孢的影响 在基础培养基中分别用等量的蛋白胨、氯化铵等八种氮源与其中的硝酸铵置换，配制成不同氮源的培养液，培养方法及测量方法同上。    
　　1.4 钠、镁盐对BTC21菌丝生长及产孢的影响 从15种碳源中选择较好的碳源红糖与蔗糖;从9种氮源中选择理想的氮源酵母浸出汁与牛肉浸膏，比较两种碳源与两种氮源在不同组合下钠、镁盐对BTC21菌丝干重及分生孢子产生情况的影响，培养及测量方法同上。    
　　1.5 不同碳氮比对BTC21菌丝生长及产孢的影响 分别按红糖:酵母为4:1、4:2、4:4、4:8、4:12的比例配制培养基，钠镁盐含量不变，培养方法及测量方法同上。
　　1.6 液体发酵BTC21最适pH的选择 综合以上结果在最佳培养基的最佳碳、氮比下用HCL与NaOH调节发酵液的初始pH，设有pH2.0～12.0共14梯度，培养条件及测量方法同上。    
　　1.7 不同培养时间对BTC21菌丝生长及产孢的影响 从培养第24h起每天定时测量孢子量的变化，测至第8天;从第72h起每天记录菌丝干重的变化，测至第16天，培养条件及测量方法同上。    
　　1.8 液体发酵BTC21最适温度的选择 将BTC21接种在按比例配制好的培养基中，分别在15℃、20℃、22.5℃、25℃、27.5℃、30℃、35℃等温度下进行振荡培养，测量5d后的菌丝干重及分生孢子量。
　　2 结果与讨论    
　　不同培养条件对木霉菌菌丝生长及产孢影响    
　　2.1 不同碳源培养BTC21后的性状及对菌丝生长与产孢的影响 液体培养基中以红糖、肝糖为碳源，培养BTC21所获得的菌丝干重最大，可能与红糖中含有其它生长所需成分有关;其次为淀粉、蔗糖、L-（+）树胶醛糖、麦芽糖、半乳糖;以山梨糖、木糖、密二糖、葡萄糖、甘露醇、果糖为碳源获得的BTC21菌丝干重较轻;以菊糖、棉子糖为碳源菌丝干重最轻。    
　　不同碳源培养后性状差异很大，缺碳对照、菊糖、棉子糖培养后产生纸屑或粉末状菌丝，不形成菌球且量极少，麦芽糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、红糖、半乳糖、密二糖、L-（+）树胶醛糖、肝糖及蔗糖为碳源，液体培养过程中易产生小菌球（d≤0.3mm）;木糖、淀粉、乳糖为碳源时可产生不同大小的菌球。并且大数碳源不利于孢子的产生，其中以果糖、密二糖为碳源的培养滤液中观察到了大量的木霉菌分生孢子;其次为蔗糖、半乳糖、菊糖、葡萄糖、L-（+）树胶醛糖与淀粉。其余8种碳源的BTC21培养滤液中几乎未见到分生孢子。综合以上结果，液体发酵BTC21最利于菌丝生长的碳源为红糖，而最利于产生孢子的碳源是果糖与密二糖。    
　　2.2 不同氮源培养BTC21后的性状及对菌丝生长及产孢的影响 液体培养中以酵母浸出汁、牛肉浸膏为氮源的BTC21菌丝生长最好，菌丝干重最大，产生d=2mm左右的小菌球;其次为蛋白胨，菌球直径达到2.5mm;菌球直径<1.5mm的谷氨酸、天门冬氨酸、硫酸氨、硝酸铵，氯化铵为氮源的菌丝干重较轻;以脲素、硝酸钾为氮源的菌丝干重最轻，且菌丝未能形成菌球。    
　　最适合BTC21产生分生孢子的氮源是酵母浸出汁、蛋白胨与硫酸铵;其次为氯化铵与天门冬氨酸;牛肉浸膏、硝酸铵、谷氨酸、硝酸钾、尿素则不利于产孢。    
　　综合以上试验结果，液体发酵BTC21最有利于菌丝生长，同时又可促进产孢的氮源为酵母浸出汁。    
　　2.3 钠镁盐对BTC21菌丝生长及产孢的影响 蔗糖、红糖、牛肉浸膏与酵母浸出汁两种碳源与两种氮源的不同组合中，在加有Na 3 PO 4 与MgSO 4 时，培BTC21所获得的菌丝干重较没有钠镁盐时大。以红糖为碳源、酵母浸出汁为氮源，在有Na 3 PO 4 与MgSO 4 存在时BTC21菌丝干重最大。观察培养后可以发现，对同碳氮组合，有无钠镁盐对菌球的形态有很大的影响，在以蔗糖为碳源、酵母浸出汁与牛肉浸膏为氮源时，加入钠镁盐情况下菌球直径变小，在2mm左右，而菌球数量明显增多，在红糖为碳源、酵母浸出汁与牛肉浸膏分别为氮源时则与上述情况不同。    
　　2.4 不同碳氮比对BTC21生长及产孢的影响 在液体培养中碳氮比为4/6时可以获得最大的菌丝干重，4/8、4/10与4/12时菌丝干重有所下降，碳氮比分别为4/l、4/2与4/4时菌丝干重较小。但培养滤液中分生孢子浓度最大的碳氮比是4/2，其次依次为4/10，4/12与4/6，在碳氮比为4/1与4/8时，滤液分生孢子浓度最小。    
　　从发酵前后pH的变化上可以看出当pH前后变化较小时菌丝干重最大。    
　　2.5 不同pH对BTC21生长及产孢的影响 液体发酵中BTC21在pH3.0～11.0之间都可观察到分生孢子，其中以pH9.0时培养滤液中孢子浓度最大，较适宜产孢的pH为 8.0～10.0;pH3.0、pH4.0及pH11.0的培养滤液中孢子量不是很大。最适宜菌丝生长的pH为5.5～6.5。    
　　2.6 不同时间对BTC21产孢的影响 从第6天开始孢子开始大量萌发生长产生菌丝，第6～8天为发酵的适宜高峰期。第8天后无论是菌丝干重还是孢子浓度都呈下降趋势。另外结合培养后的pH变化来看，第1～8天，滤液pH偏酸性，利于菌体生长及产孢，第9～16天pH偏碱性，不利于菌体生长及产孢，原因可能是在有限的营养浓度内菌体达到最大增长限度后自身开始产生一些碱性物质抑制自身生长并伴有菌体自溶的现象，一般培养12天后培养物变稀状物、菌球消失。    
　　2.7 不同温度对BTC21发酵的影响 菌丝干重最适宜温度在22.5℃～25℃之间，产孢适宜温度在25℃～27℃之间，30℃时孢子量便急剧变少。    
　　3 结论
　　研究中发现BTC21菌丝生长和分生孢子形成对碳源和氮源都有不同的选择性，可根据制备目的来选择。如在制备以菌丝型为主的木霉菌生防制剂时最好选择红糖和肝糖，菌丝型制剂对培养产生抗生素类物质及胞壁降解酶有利。要制备分生孢子型木霉菌生防制剂时则需要选择果糖与密二糖，孢子型制剂对营养和空间竞争有利。因此在研究木霉菌发酵培养基时要考虑实际应用中对制剂的具体要求。本研究发现二糖或多糖比单糖有利于木霉菌主长。今后需要考虑在不同发酵或生长阶段研究木霉菌碳、氮种类的要求，便于今后生防木霉菌的补料发酵或连续发酵。本研究明确了木霉菌产孢和菌丝体形成的最佳条件，在最佳培养时间、pH、温度等方面都明显不同，因此可以根据生防制剂质量标准和要求来进行选择，如偏酸条件有利于菌丝主长，偏碱条件则有利于产孢;培养中前期有利于孢子形成，而中后期利于菌体生长。相比较而言，适合产孢的培养时间范围较窄，约第5～7天收集孢子最理想。与此类似的还有，比较适合菌丝生长的温度范围较宽，而有利产孢的适温在22.5℃～27℃之间。在工业发酵过程中，pH的变化也会直接影响目的产物的积累，需要根据目的产物的不同来调节pH，若需要同时获得多项产物时（如酶、孢子及菌丝等），可在培养过程中调节pH的变化以完成分段产物的积累。总之，在研究发酵条件时要尽量测定培养条件对菌种生物学指标的影响才能生产出各种不同要求的目的产物

 

上一篇：分支杆菌药物敏感性测定的几个问题医学文献

下一篇：分支杆菌药物敏感性测定的几个问题