临床微生物实验室细菌鉴定指南（上）

一．细菌的鉴定步骤

1． 鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有已知菌种进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程。

2． 对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板上生长良好，有单个菌落可以进行生化试验。（我们这里一般都是预先纯化培养）

3． 对待鉴定的菌种进行革兰染色，观察形态（G⁺c，G^–b，G^–c，G⁺b），做触酶，氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。要注意对待鉴定的菌种选择一个合适的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。

4． 按鉴定质控单的要求填写好病人姓名，年龄，性别；标本类型，标本编号，送检日期等。另外最重要的是要填写好该菌种的菌落形态以及有无溶血。

5． 复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。

⑴．革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最基本最重要的染色方法。

首先要将待鉴定的细菌涂片，固定（目的：杀死细菌，改变细菌对染料的通透性）。

第一步：以结晶紫初染（染色液Ⅰ）

第二步：以卢戈氏碘液媒染（染色液Ⅱ）

第三步：用95%乙醇脱色（染色液Ⅲ）

第四步：最后用稀释复红复染（染色液Ⅳ）

⑵．触酶实验(H₂O₂实验)：

a.原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。

b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开，滴加3%过氧化氢数滴，观察结果（立即有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性）。要注意不能在血平板上进行实验，这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假阴性结果；还有不能在接种针或环上进行实验。

c.阳性对照用金黄色葡萄球菌，阴性对照用链球菌；试剂要避光置4℃冰箱保存。

d.应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实验阳性，链球菌属阴性。临床常见细菌鉴定实验中我们一般用于区别葡萄球菌属（+），微球菌属（+），链球菌属（－）。

⑶．氧化酶实验（Kovac实验）：

a.       原理：氧化酶又称细胞色素酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。酶并不直接与试剂（1%盐酸四甲基对苯二胺）起反应，而是首先使细胞色素c氧化，然后氧化型细胞色素c使对苯二胺氧化，出现深兰色反应。

b.       方法（滤纸法，菌落法，试剂纸片法）：

一般我们采用滤纸法，取白色洁净滤纸条，沾取菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即呈粉红色，继而出现深兰色。结果读取在10秒钟时为最佳，60秒内读取可靠。本实验避免接触含铁物质（假阳性），也不能在含糖培养基上生长的菌落进行实验（假阴性）。

c.       阳性对照用铜绿假单胞菌，阴性对照用大肠埃希菌。

d.       应用：奈瑟氏属的菌种均阳性，也用于区别假单胞菌属和肠杆菌，前者阳性，后者阴性。

 二．葡萄球菌属的鉴定

  葡萄球菌属主要的种有金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌。

1． 形态与染色：葡萄球菌直径0.5～1.5μm，菌体圆形，呈单个，成双以及不规簇状排列。染色呈紫色，为革兰阳性球菌。

2． 与链球菌的区别：触酶实验为阳性，而链球菌阴性；菌体形态链球菌小于葡萄球菌，呈成双和链状排列的卵圆形的革兰阳性球菌。

3． 与微球菌的区别：触酶实验同为阳性，但微球菌的菌体呈四联状，要大于葡萄球菌，微球菌葡萄糖氧化发酵实验（操作方法同甘露醇OF试验）为氧化型；而葡萄球菌为发酵型。另外呋喃唑酮（即痢特灵50μg/片）敏感实验微球菌为耐药，而金黄色葡萄球菌为敏感。

4． 葡萄球菌属的种间鉴定：

⑴．菌落色素与溶血毒素：金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄色，柠檬色或者淡黄色，而其他葡萄球菌则在血平板上菌落大多数为白色，也有部分为柠檬色或深黄色。

⑵．溶血毒素：金黄色葡萄球菌有α﹑β﹑γ﹑δ溶血毒素，各毒素的区别是对动物红细胞的溶血范围﹑抗原性及溶血时的温度等。其中以α溶血毒素为主。而其他葡萄球菌大多数不产生溶血毒素，只有表葡有极少能产生溶血毒素。

⑶．血浆凝固酶实验：用与区别金黄色葡萄球菌（阳性），表皮葡萄球菌（阴性），腐生葡萄球菌（阴性）。血浆凝固酶是金葡菌所产生的，有结合凝固酶和游离凝固酶两种。血浆凝固酶检测有两种方法，为玻片法和试管法，我们一般采用玻片法。

a. 操作方法：挑取少许金黄色葡萄球菌菌落在玻片上与血浆乳化，结合凝固酶能作用于血浆中的纤维蛋白原，从而在金黄色葡萄球菌表面发生凝集，所以我们肉眼能看见凝集颗粒。玻片法主要由结合凝固酶作用产生；游离凝固酶是金黄色葡萄球菌产生的胞外酶，能与血浆中的血浆凝固反应因子（类似凝血酶的一种物质）作用，形成复合物再使纤维蛋白原转化成纤维蛋白而发生凝集。试管法主要由游离凝固酶作用产生。

b. 注意事项：菌落不能太多，否则会影响结果观察；凝固酶阳性要做自凝阴性对照（用生理盐水代替血浆），只有在阴性对照也不凝集才能认为是真正的阳性，有一部分葡萄球菌有自凝现象。

⑷．新生霉素敏感实验：金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌对新生霉素纸片（5μg/片）敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌则对之耐药。抑菌环直径>16mm即为新生霉素敏感。

⑸．甘露醇氧化发酵实验：

a.操作方法：取两支甘露醇微量生化管，在微量管内接种待检细菌，然后一支加两滴石腊密封，另外一支则不加，放37℃孵箱内18～24h后观察结果。

b.结果观察：微量生化管变黄色为阳性，也就是能利用甘露醇。若两管都变黄色则说明是发酵型；其中加石蜡管不变色，没加石蜡管变黄色则为氧化型；如果两管都不变色则说明该细菌是不利用甘露醇（产碱型）。

c.应用：金黄色葡萄球菌在需氧和厌氧的条件下都能利用甘露醇（即两管都变黄色）；表皮葡萄球菌需氧部分产酸，厌氧条件下不利用甘露醇（即没加石蜡管有部分会变黄色，加石蜡管不变黄色）；腐生葡萄球菌与表皮葡萄球菌类似。

 三．微球菌属的种间鉴定

微球菌属主要的种有易变微球菌，藤黄微球菌，玫瑰微球菌。鉴定生化见下表

       d：不定     S：敏感     R：耐药

 四．链球菌属

1． 形态和染色：链球菌的直径为0.5～1.0μm，呈成双和链状排列的卵圆形革兰阳性球菌，菌体小于葡萄球菌，无鞭毛，没有芽胞，但有些菌株会形成荚膜。肺炎链球菌呈矛头状，宽端相对，尖端向外。

2． 根据链球菌在血平板上溶血现象的不同分为三种：⑴甲型（α-）溶血，即菌落周围出现较窄的草绿色溶血环；⑵乙型（β-）溶血，即菌落周围出现较宽的透明溶血环；⑶丙型（γ-）溶血，即菌落周围无溶血环。

3． 根据抗原结构（C多糖抗原）的不同可分为A﹑B﹑C﹑D﹑E﹑F﹑G﹑H﹑K﹑L﹑M﹑N﹑O﹑P﹑Q﹑R﹑S﹑T等18个群，对人类有致病者90%属于A群，偶见其他群链球菌致病。

4． 链球菌属的种间鉴定

⑴．乙型溶血链球菌的鉴定：

a． 对杆菌肽（0.04U/片）（抑菌圈直径≥10mm）敏感：A群链球菌（主要为化脓性链球菌）。

b． 对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，但马尿酸钠水解实验﹑CAMP实验阳性：B群链球菌（主要为无乳链球菌）。

c． 对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，马尿酸钠水解实验阴性，CAMP实验阴性：主要为马链球菌﹑类马链球菌﹑兽疫链球菌；对三者的区别实验要加做海藻糖和山梨醇实验。

d． CAMP实验：将能产生β-溶血的金黄色葡萄球菌在血平板上划一横线接种，再将待鉴定菌于金黄色葡萄球菌3mm处垂直种一短线，若在有CO₂条件下培养5～6小时，或无CO₂条件下培养18～24小时，在两细菌连接处出现一个半月型的加强溶血区即为CAMP实验阳性。

⑵．甲型溶血链球菌的鉴定：

a． 草绿色链球菌：对杆菌肽敏感，对奥普托欣（Optochin）不敏感，胆汁溶菌实验阴性，胆汁七叶苷实验阴性，在高盐中不生长。主要有变异链球菌，轻型链球菌，血链球菌，唾液链球菌等。

b． 肺炎链球菌：菌体呈矛头状，成双排列，钝端相对，尖端相背，较葡萄球菌，其他链球菌略大；在血平板上菌落细小﹑圆形﹑表面光滑﹑灰白色﹑半透明，开始时菌落呈扁平状，以后中心塌陷，呈脐窝状。与草绿色链球菌的主要区别是胆汁溶菌实验阳性，对奥普托欣（Optochin）敏感。奥普托欣（Optochin）含量为5μg/片，抑菌环>18mm为敏感，<15mm为不敏感，15～18mm应重复实验。

⑶．肠球菌（D群链球菌）的鉴定：

溶血不定，主要是α-﹑γ-溶血；对杆菌肽不敏感，但其特异性实验是胆汁七叶苷实验阳性；若能在6.5%NaCl的心浸液肉汤中生长即为D群肠球菌，不能生长为D群非肠球菌。

⑷．链球菌属鉴定的系统生化结果判断

a． 1%美兰牛乳

b． 胆汁七叶苷实验：变黑为阳性。

c． PH9.6肉汤实验：变浑浊为能在碱性环境中生长（阳性）。

d． 6.5%NaCl心浸液肉汤：由紫变黄为能在高盐环境中生长（阳性）。

e． 精氨酸双水解酶实验：变红色（对照不变色，仍为黄色）为阳性。

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