白藓组织培养及无性系建立的研究

【摘要】  　　目的对白藓资源进行种质保存，满足人们栽培对种苗的需求。方法以白藓嫩茎为材料，以植物组织培养方法为手段，进行了愈伤组织诱导，愈伤组织和不顶芽分化，试管苗生根，试管苗移栽、扦插和移植的研究。结果1/2MS+BA0.5 mg•L-1+NAA1.0～1.5 mg•L-1为嫩茎愈伤组织的诱导培养和继代培养的理想培养基；MS+AgNO31.5mg•L-1+BA0.8mg•L-1+naa0.2mg•L-1是嫩茎愈伤组织和不定芽分化培养的理想培养基；1/3MS+IAA0.4～0.6mg•L-1是生根培养和试管苗生根继代培养的理想培养基；移栽的试管苗保持了野生白藓的所有生物学性状，成功地建立起白藓的无性系。结论嫩芽诱导的愈伤组织建立的无性系能对其进行种质保存，所繁殖的种苗能满足人们栽培的需求。 
【关键词】  白藓； 愈伤组织； 无性系； 快速繁殖
    白藓Dictamnus dasycarpus，又称八股牛，属于芸香科白藓属多年生草本植物，生长于山坡、林下、林缘和草地。在我国的东北、华北、西北和华东等地有分布，朝鲜、蒙古和俄罗斯也有分布［1～3］。白鲜叶可提取芳香油；根茎作农药用，可防治多种病虫害；根皮（白藓皮）入药，具有解毒、祛热、利尿、除湿和杀虫等功效，能治皮肤瘙痒、湿疹、黄水疮、黄疸、肝炎和阴部瘙痒等疾病［3～5］。由于白藓既可作无公害的农药，又是治疗多种疾病的中药，从而出现了人们大量采收，数量越来越少的现象。于是，辽宁南部地区有人试图对其进行栽培，但由于人们长期地过量采挖，已经难以收集到种子，只能将有限的野生植株挖回来作为种苗，这又使数量非常少的野生白藓资源遭到了破坏。于是，我们对白藓进行了组织培养及无性系建立的研究，以期满足人们栽培对种苗的需求。虽然已多有芸香科植物组织培养研究的报道［6～9］，但迄今未见白藓组织培养及无性系建立的研究的报道。本研究以白藓的嫩茎为材料，成功地诱导形成愈伤组织，建立起无性系。
　　1  材料
　　1.1 材料及灭菌五月上旬至中旬，将林缘草地上长势非常旺盛的白藓嫩茎切下后，放到500 ml的磨口广口瓶中，用自来水振荡洗涤30 min左右，再用0.05 %安利洗涤液振荡洗涤20 min左右，然后移到超净工作台上，用70%～75%的乙醇灭菌约15 s后，迅速用无菌水振荡洗涤2次，倒入0.05 % HgCl2 溶液振荡灭菌3 min，接着用0.025 % HgCl2 溶液振荡灭菌8 min，再用无菌水振荡洗涤6次漓干后，将装有材料的瓶子置于27℃的温箱中放置24 h，然后再用0.025%HgCl2灭菌6 min，接着用无菌水洗涤6次。即可获得白藓无菌嫩茎。
　　1.2  培养条件以MS，1/2MS，1/3MS为基本培养基，附加不同种类不同浓度的BA，IBA，IAA，NAA和2,4-D。以MS为基本培养基加蔗糖30 g•L-1，以1/2MS为基本培养基加蔗糖15 g•L-1，以1/3MS为基本培养基加蔗糖10g•L-1。培养基胨力强度为180 g/cm2［10］，pH为5.8～6.0，培养温度20～25℃，光照度3 000 Lx左右，光照10～12 h•d-1。
　　2  方法
　　2.1  不同培养基对愈伤组织的诱导的影响
　　将无菌嫩茎用解剖刀切成长约0.2 cm的无生长点茎段，接种到附加不同浓度BA、IBA、NAA的1/2MS培养基上，进行愈伤组织的诱导培养。培养到50d时观察统计培养结果。嫩茎愈伤组织的诱导试验重复了3次，每次试验继代培养5代。
　　2.2  不同激素愈伤组织分化的影响 
 
　　将继代培养45 d生长一致的愈伤组织颗粒分散成独立的颗粒后，接种到以MS+ AgNO31.5 mg•L-1为基本培养基，附加不同浓度BA、2,4-D或NAA的培养基中，进行愈伤组织的分化培养。每种培养基接种100个愈伤组织颗粒，统计观察分化率和分化不定芽的生长状况。
　　2.3  不同浓度IAA对不定芽生根的影响
　　把上述继代培养的丛生状、生长旺盛、高0.5 cm以上的不定芽从基部剪下，接种到以1/3MS为基本培养基，附加浓度分别为0.2，0.4，0.6 ，0.8，1.0 ，1.2 mg•L-1和1.4 mg•L-1的IAA培养基上，进行不定芽的生根培养。生根实验重复了3次，每次试验接种200个不定芽。
　　2.4  试管苗的移栽、扦插把继代培养的生根试管苗培养瓶移到日光温室中，除掉培养瓶瓶塞，在4000～7000Lx光照下炼苗4 d，用镊子将试管苗取出，在清水中洗去根部培养基后，移栽到上面分别铺着一层厚为6～7 cm的河沙、珍珠岩、山皮土、园土、炉灰渣（小颗粒状）5种移栽基质、下面为肥沃园土的温室苗床上。移栽后前15 d保持相对湿度为95％左右、温度20～28℃、没有直射光的条件。
    
　　把经过上述炼苗4 d的试管苗取出后，剪成长2cm左右，至少具有两个腋芽或一个顶芽和两个腋芽的茎段后，将最下面的一个叶片剪掉后，把下部切口在浓度为90 mg•L-1的IAA溶液中浸泡处理4～6 min后取出，直接扦插到上面覆盖着一层上述五种事先已经浇透水的移栽基质的苗床上，并采用与移栽相同的条件进行管理。
3  结果
　　3.1  不同培养基对愈伤组织的诱导的影响由表1可见，接种到附加不同浓度BA、IBA的培养基中不能诱导形成愈伤组织；接种到附加不同浓度BA、NAA的培养基上都能诱导形成愈伤组织。但从愈伤组织的诱导率和长势看两个方面看，以8、9号两种培养基的诱导效果好。在这两种培养基上培养的材料，不仅诱导率达100％，而且愈伤组织长势好。观察还表明，接种在这两种培养基上的外植体，培养到10 d时，大部分培养材料在切口部开始出现愈伤组织，随后愈伤组织开始迅速生长。初期形成的愈伤组织为无色、光滑的半透明状，后来逐渐生长变化成为直径在0.1cm左右的绿色颗粒状。
    
　　把上述两种培养基上由嫩茎诱导培养的、生长状态一致的绿色颗粒状愈伤组织分散为独立的颗粒后，接种到相同的培养基上进行愈伤组织的继代增殖培养。在相同的培养条件下培养45 d。经过3次重复试验，每次重复试验继代培养5代的研究证明：初期培养的愈伤组织为浅绿色颗粒，后来伴随着颗粒状愈伤组织的迅速生长增殖，逐渐变成为绿色的颗粒。培养45 d的增殖系数为28.5。上述试验结果说明，1/2MS+BA0.5 mg•L-1+NAA1.0～1.5 mg•L-1的培养基为白藓嫩茎颗粒状愈伤组织的诱导培养和继代培养的理想培养基。表1  不同培养基对愈伤组织诱导的影响（略）
　　3.2  不同激素对愈伤组织分化的影响由表2可以看出，在不同浓度的BA与不同浓度NAA配合使用的培养基上，颗粒状愈伤组织的分化情况较好，尤其是浓度为0.8 mg•L-1的BA与浓度为0.2 mg•L-1的NAA培养基上，不仅愈伤组织的分化率达到了98%，而且分化不定芽长势好。试验过程中的观察还发现，在这一培养基上分化培养10 d左右愈伤组织颗粒即可分化出可见的浅绿色芽点，随后，伴随着愈伤组织颗粒的不断分化增加和分化不定芽的生长，先分化的不定芽基部又会分化出数量不等的不定芽，形成了绿色的丛生不定芽。分化培养到45 d时，每个愈伤组织颗粒就会分化形成为有3～9个不定芽组成的丛生不定芽。
    
　　把上述分化培养的绿色不定芽从基部剪下，接种到相同的培养基上进行不定芽的分化培养。经过3次重复试验，每次重复试验继代5代的研究证明：不定芽经过40 d培养，平均每个培养的不定芽可再分化生长出高0.5 cm以上不定芽5.4个。观察还表明，经过40 d的培养，所培养的不定芽都分化生长为丛生状，并且分化的不定芽叶片伸展、茎较粗壮、生长旺盛。
    
　　上述说明，MS+ AgNO31.5 mg•L-1+BA0.8 mg•L-1+NAA0.2 mg•L-1这一培养基是白藓嫩茎颗粒状愈伤组织和不定芽分化培养的理想培养基。表2  不同激素愈伤组织分化的影响（略）
　　3.3  不同浓度IAA对不定芽生根的影响试验观察表明，不定芽接种培养8 d时，有的培养基上开始出现根原基。培养到25 d时观察统计的3次重复试验的平均结果证明：在附加浓度为0.4 mg•L-1，0.6 mg•L-1的IAA培养基上，不仅平均生根率达到了96.5%和97%，平均每株生根数为6.1条，而且生根试管苗长势旺盛。观察还表明，不定芽接种到上述两种培养基上10 d时，培养材料几乎都形成了根原基，随后伴随着根的伸长生长，试管苗也迅速生长。培养到25d时，就可以生长成为高4～5 cm左右、叶片伸展、茎粗壮、根系发达的旺盛试管苗。把生根试管苗剪成长1cm左右、至少具有两个腋芽或顶芽的茎段，接种到相同的培养基上进行生根继代培养。经过25 d的培养，又可以培养成1代旺盛的试管苗。经过3次重复试验，每次重复实验6代的继代培养研究证明，用这种生根继代培养的方法进行繁殖，不仅培养材料的生根率近100%、25 d的繁殖系数为3.1，而且几乎没有无效苗，繁殖试管苗生长非常旺盛。上述结果说明，1/3MS+IAA 0.4～0.6 mg•L-1这一培养基是白鲜不定芽生根培养和试管苗生根继代培养的理想培养基。
　　3.4  试管苗的移栽、扦插和移植移栽后10 d可见成活生长，25 d时观察统计证明，以河沙和炉灰渣为移栽基质平均成活率分别为95%，97.4%，移栽成活后15 d左右开始正常生长。
    
　　扦插后15 d可见成活生长，30 d时观察统计证明，以炉灰渣为扦插基质，成活率为91%。扦插苗前50 d植株较小，后期长势与移栽苗一致。上述说明，炉灰渣是白鲜试管苗移栽和扦插的理想基质。
    
　　把在日光温室中移栽、扦插成活的试管苗于五月中旬和下旬先后两次移植到山坡上，移植的白藓试管苗保持了野生白藓的所有生物学性状，但与当年的白藓实生苗相比，试管苗移植后的前70d生长较慢、植株较小，后期叶色浓绿、生长非常旺盛而整齐，根系发达（相当于实生苗的1.5～2倍），移植苗当年可正常开花结实。
　　4  讨论
    本研究以无生长点嫩茎为材料建立起白藓的无性系。这说明白藓的非分生细胞和组织也具有全能性。
    用愈伤组织的继代培养的方法进行繁殖，45 d的增殖系数为28.5。按照这个速度计算，每年的繁殖数量为28.58个；用不定芽分化继代的方法进行繁殖，平均40 d能培养5.4个不定芽。按照这个速度计算，每年的繁殖数量为5.49个；用生根继代的方法进行繁殖，25 d的繁殖系数为3.1。按照这个速度计算，每年的繁殖数量为3.114.6个。上述计算结果证明：无论采用上述哪种方法进行繁殖，每年都能繁殖出大量的试管苗，满足人们生产对大量种苗的需要，但由于采用生根继代的方法繁殖的试管苗生长旺盛、没有无效苗。所以，生产上应采用生根继代的方法繁殖白藓试管苗。
    现在许多研究指出，通过继代培养的愈伤组织分化的试管苗容易发生变异［11～12］，但在本研究中由白藓无生长点嫩茎愈伤组织诱导培养的的试管苗不仅保持了白藓的所有生物性状，并且试管苗长势旺盛而整齐。这可能是由以下原因引起的：一是本研究的环境较为稳定，不易使培养材料发生变异；二是白藓本身具有稳定的遗传性，不易受到培养环境的影响发生变异。这说明通过白藓嫩茎诱导的愈伤组织建立的无性系能够对其进行种质保存。
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