微量法检测曲霉对六种抗真菌药物的敏感性

1997年美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）公布了M27-A方案，即酵母菌的液体培养基稀释法抗真菌药物敏感试验标准方案，表明酵母菌的体外药敏试验已趋于标准化，而丝状真菌药敏试验还在不断发展。我们以此方案中的微量法为基础，探讨并建立曲霉的标准化药敏试验方法。

　　一、材料和方法

　　1.试验菌株来源：受试菌株31株：烟曲霉14株、黄曲霉8株、黑曲霉5株、构巢曲霉3株和土曲霉2株。试验菌株由临床株和环境株组成，主要由北京医科大学第一医院、中国科学院微生物研究所等提供。

　　2.抗真菌药物包括：5-氟胞嘧啶（5-FC） 和两性霉素B（AmB）由Sigma公司提供，氟康唑（FCZ）由三维制药公司提供，酮康唑（KCZ）和伊曲康唑（ICZ）由杨森制药公司提供，特比萘芬（TBF）由诺华制药公司提供，贮存液的制备详见参考文献［1］。

　　3.培养基：RPMI-1640液体培养基，唯有TBF试验用2%沙氏液体培养基(SDB)。

　　4.方法：参照NCCLS方案（1997年版）^［2］进行，但有如下几点说明。(1)TBF药液制备：TBF贮存液用SDB稀释，终浓度0.0313～16 μg/ml。(2)菌悬液制备：将受试菌株在麦芽培养基30℃生长7～10天，菌悬液经振荡和培养基稀释，其终浓度至0.5×10⁴～2.5×10⁴CFU/ml。(3)结果判定：经30℃培养46～50小时后观察结果。本试验结果AmB取0：肉眼清晰为判定终点，其余5种药物取Ⅰ：略模糊（80%受抑制）或Ⅱ：浊度显著减低（50%受抑制）为判定终点^［2，3］。

　　三、结果

　　1、6种抗真菌药物对31株曲霉的MIC值的几何均数及MIC值范围见表1。ICZ与TBF对31株曲霉的MIC值的几何均数较低，ICZ仅对3株曲霉的MIC值≥1 μg/ml，其中对2株的MIC值为1 μg/ml，对1株的MIC值为2 μg/ml；TBF对4株曲霉菌的MIC值≥1 μg/ml，其中3株MIC值为1 μg/ml，对1株MIC值为2 μg/ml；AmB的MIC值集中在1 μg/ml或2 μg/ml，其中AmB对15株的MIC值＞1 μg/ml，其中MIC值为2 μg/ml、4 μg/ml和8 μg/ml者分别为10株、3株和2株；KCZ对20株曲霉菌的MIC值＞1 μg/ml；FCZ对12株曲霉菌的MIC值≥64 μg/ml；5-FC对20株曲霉菌的MIC值≥32 μg/ml，其中11株的MIC值为32 μg/ml，9株的MIC值≥64 μg/ml。

　　2.将6种药物对曲霉菌的MIC值进行秩和检验，结果表明，ICZ和TBF对曲霉菌的MIC值均值明显低于其他4种药物(P＜0.01)。

表1　6种抗真菌药物对5种曲霉菌的MIC值几何均数及范围(μg/ml)

　　注：5-FC：5-氟胞嘧啶；FCZ：氟康唑；KCZ：酮康唑；ICZ：伊曲康唑；AmB：两性霉素B；TBF：特比萘芬四、讨论

　　目前丝状真菌药敏试验的理想条件是：(1)接种浓度10⁴CFU/ml；(2)孵育时间48～72小时；(3)终点判读宜通过比色法，得到更为精确的MIC值^［3，4］。

　　在试验中，ICZ、TBF的MIC值较低，显示曲霉菌对这两种药物高度敏感，其中MIC值≥1 μg/ml的菌株，ICZ仅有3株，TBF仅有4株。资料表明^［5］，临床治疗中发现的ICZ耐药菌株，其MIC值≥16 μg/ml，而本试验ICZ的MIC值全部小于16 μg/ml，说明目前国内曲霉菌株仍对ICZ高度敏感，尚未发现耐药株；资料^［6］表明，TBF对曲霉有较强的抑菌作用，其均值MIC50/MFC90为0.4～1.6 μg/ml，其耐药标准与AmB相当，在与AmB、KCZ、5-FC相比的曲霉药敏试验中，其敏感性明显高于这些药物，表明TBF有可能用于曲霉病的治疗。AmB和KCZ的MIC值较高，其中MIC值＞1 μg/ml的菌株分别为15株和20株；对于5-FC和FCZ，依据M27-A方案念珠菌的耐药标准，5-FC的MIC值≥32 μg/ml的菌株有20株，FCZ的MIC值≥64 μg/ml的菌株有12株，表明后4种药物对曲霉的敏感性较差。值得说明的是，31株曲霉菌中AmB的MIC值＞1 μg/ml有15株，而临床工作中，AmB治疗曲霉病有较好的疗效^［5］，这一点可能恰好反映出M27-A方案本身对AmB的耐药性检测不敏感的问题。

　　志谢　本课题得到北京医科大学第一临床医院诺华真菌研究中心的资助

　　参考文献

　　[1]　王文莉，王端礼，李若瑜，等.酵母菌的NCCLS药敏试验方法及其应用.中华医学检验杂志，1997,20:119-122.

　　[2]　National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast; approved standard M27-A. Pennsylvania:NCCLS, 1997.1-21.

　　[3]　Espinel-Ingroff A, Bartlett M, Bowden R, et al. Multicenter evaluation of proposed standardized procedure for antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. J Clin Microbiol，1997,35:139-143.

　　[4]　刘伟，李若瑜，王端礼．丝状真菌药敏试验的研究进展.中华医学检验杂志，1997,20:313-315.

　　[5]　Denning DW,Venkateswarlu K, Oakley KL,et al. Itraconazole resistance in Aspergillus fumigatus. Antimicrob Agents Chemother，1997,41:1364-1368.

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