旱半夏组织培养条件的优化研究

【摘要】  　　目的优化旱半夏的组织培养条件。方法以旱半夏小块茎为外植体进行组织培养。结果与结论使用卡拉胶代替琼脂固化，取得了良好的效果；旱半夏继代增殖最适培养基为：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，增殖系数达到6.5，平均苗高达2.5 cm；生根最适培养基为：1/2MS+NAA 0.1 mg/L，生根数4～5条，生根率达到100%。

【关键词】  旱半夏；组织培养；卡拉胶

　　Abstract：Objective To optimize tissue culture condition of pinellia tenata(Thumb)Breit.Methods With the tuber of Pinellia tenata(Thumb.)Breit as explant,the culture condition of tissue culture was optimized by tissue culture.Results and Conclusion The effect of κ-Carrageenan replacing of agar is good.The suitable subculture Proliferation medium is MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5 mg/L,the coefficient of proliferation get to 6.5,the average height is 2.5 cm,the suitable rooting medium is 1/2 MS+NAA0.1 mg/L,the rooting count is about 4～5,and the ratio of rooting gets to 100%.

　　Key words：Pinellia tenata(Thumb.)Breit;   Tissue culture;   κ-Carrageenan

    半夏pinellia tenata(Thunb.)Breit为天南星科多年生草本植物，以块茎入药，是一种重要的中药材。其性温，味辛，有小毒，归脾、胃、肺，经炮制后具有润燥化痰、降逆止呕、消痞散结之功效［1］。

    旱半夏多为野生，尽管具有明显的杂草性，但其繁殖系数较低，又缺乏有效的传播方式，因而是一种开拓性差的物种［2］。近年来随着连年采挖，野生资源日趋枯竭，远不能满足市场需求。人工栽培时，采用大块茎出售，珠芽、小块茎育苗，用种量大，成本高。小块茎无性繁殖易使半夏产量降低，品质退化，使半夏的栽培生产受到限制。利用组织培养建立半夏无性快速繁殖系统，可提高其繁殖系数，同时可防止品种退化问题。
   
　　本研究主要是对半夏组织培养条件进行优化，为大规模进行工厂化生产提供技术支持，前人研究中培养基使用琼脂固化，本研究尝试使用卡拉胶代替琼脂固化，取得了良好的效果，卡拉胶较琼脂价格低很多，因此可以为大规模进行工厂化生产节约成本。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料旱半夏小块茎， 购于安国市北方药材种子经销站。

　　1.2  消毒方法

　　取健康的旱半夏小块茎，用清水洗净，放于超净工作台中灭过菌的空三角瓶中，先用含有吐温的0.1%的升汞溶液消毒10～12 min，再用75%的酒精消毒30～60 s，最后再用无菌水冲洗5～6次，备用。

　　1.3  培养基及试验

　　设计设计以MS、1/2MS为基本培养基，基于我们的研究目的旨在指导并应用于大生产，所以为尽量节约成本和适应大规模生产所需，本试验选择了细胞分裂素中效果较好且最为廉价常用的6-BA、生长素选择了NAA，以期筛选出适合于半夏生产的最佳培养基。

    发芽培养基：MS。   
　　继代增殖培养基：在MS培养基中分别附加BA0.5，1.0，2.0，3.0 mg/L；NAA0.05，0.1，0.2，0.5 mg/L；采用二因素完全随机设计（见表1）进行最适激素配比的筛选，共计16个处理组合（见表2），每个处理接4株无菌苗，重复3次。表1  激素配比二因素完全随机设计因素水平（略）

    生根培养基：在1/2MS培养基中分别附加0，0.01，0.05，0.10 mg/L NAA。

　　1.4 培养条件

　　所有培养基皆以浓度为0.7%的卡拉胶固化，含蔗糖均为3%，在高压灭菌前将pH值调至5.8，温度为（25±2）℃。光照1 500～2 000 lx，每日光照时数12～14 h。

2  结果

　　2.1 无菌苗的获得

　　将小块茎接种到MS培养基中进行发芽培养，培养4～7 d内进行观察统计发芽情况。观察统计发现，当培养7 d时，小块茎的发芽率达到了100%，继续培养无菌苗长势良好。

　　2.2  继代增殖培养

　　将小块茎发芽得到的无菌苗接种到表2处理组合的培养基中，培养1周左右无菌苗上端死亡，而在基部开始膨大，培养2周时形成愈伤组织（见图1），培养3周时愈伤组织分化成苗（见图2），培养4周时对其进行观察和相关数据统计。
   
　　从表2可见，1～6号培养基中组培苗没有增殖，而7～16号培养基均有一定程度的分化增殖，但是差别相对较大。从分化出的苗的高度以及增殖系数来看11号培养基最佳，增殖系数达到6.5，平均苗高达2.5 cm。其他培养基的增殖系数分布在1.2～4.0之间，平均芽苗高分布在1.2～2.0之间。从而筛选出最适继代增殖培养基为： MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L。继代分化增殖情况见图3。表2  植物激素配比对旱半夏继代增殖培养的影响（略）

　　2.3 生根培养

　　选择继代培养后生长健壮并且有一定高度的试管苗，将其分成单株，分别接种到生根培养基上培养，10 d后观察并统计结果。见表3。表3  不同生长素浓度对旱半夏生根的影响（）

    从表3可见，NAA的浓度以0.1 mg/L时为最佳浓度，可长出4～5条根，生根率达到100%，从而筛选出最适生根培养基为：1/2MS+NAA0.1 mg/L，并且在此培养基上生长的组培苗根部无愈伤组织形成，有利于下一步移栽的成活。

　　2.4  移栽

　　选择生根良好的试管苗进行移栽，移栽前，先将试管苗从培养室中移至气温较低的室内进行练苗2～3 d，而后再在室内开瓶练苗2～3 d，最后，在瓶内加少许自来水练苗1～2 d后将其移栽至经高压灭菌的栽培土中，栽苗后需浇透水，初期加盖覆盖物，保温保湿，管理期间，土壤切忌太湿和应注意保持空气湿度。当确定苗已经成活并且长势良好时，再将覆盖物去掉暴露在空气中生长。

　　3 讨论

    旱半夏分化增殖最适培养基为：MS+6-BA2.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L，增殖系数达到6.5，平均苗高达2.5 cm；生根最适培养基为：1/2MS+NAA0.1 mg/L，生根率达到100%。
   
　　在生根过程中选苗是很关键的，苗的高度不是主要因素，主要还是要看其健壮程度，细弱的苗生根移栽后是很难成活的。应选择健壮且有一定高度的组培苗来进行生根培养，生根后根部应没有愈伤组织形成，如果有愈伤组织即使根长的很好，移栽后也很难成活。移栽时最好在根长1～1.5 cm之间时，根长的太长后已老化，吸收养分的能力下降导致苗不易成活。

【参考文献】
  　　［1］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000:89.

　　［2］郭巧生.半夏研究进展［J］.中药研究与信息,2000,2(10):15.

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