紫丹活血片微生物检查方法学验证

摘 要：目的：建立紫丹活血片微生物限度检查标准方法。方法：按《中国药典》2005版的有关要求.通过接种代表性的阳性菌株，采用常规法、薄膜过滤法、稀释法进行方法学验证。结果：常规法对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉菌的回收率均高于70%，对枯草杆菌、白色念珠菌的回收率均低于70%。采用薄膜过滤法每筒冲洗400ml(分4次)，可以消除样品对枯草杆菌、白色念珠菌的抗菌活性，使其正常生长；控制菌检查采用稀释法进行检查。结论：本样品可以采用薄膜过滤法及稀释法进行测定。

    关键词：紫丹活血片；微生物限度检查；常规法；薄膜过滤法；稀释法；冲洗量；方法学验证

    中图分类号：R927.1 文献标识码：A

    文章编号：1007-2349(2007)12-0034-02

    紫丹活血片具有活血化瘀，理气止痛之功能.临床用于气滞血瘀所致胸痹(冠心病心绞痛)、眩晕(脑动脉硬化)。当建立药品的微生物限度检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定及控制菌检查。按《中国药典》2005版的有关要求，通过接种代表性的阳性菌株，发现紫丹活血片具有抑菌活性，采用薄膜过滤法，可以消除紫丹活血片抑菌活性，确定了薄膜过滤法的最佳冲洗量和实验条件，建立了微生物限度检查方法。

    1 仪器与材料

    1.1仪器 HTY-Ⅲ型智能集菌仪，(杭州泰林医疗器械厂生产；开放式一次性薄膜过滤器，北京牛牛基因技术有限公司，批号：20051005)。

    1.2样品 紫丹活血片(云南天利药业有限公司生产，规格0.4g/粒，批号20060301)。

    1.3培养基 胆盐乳糖增培养基(批号，05222)，玫瑰红钠琼脂培养基(批号，030710)，营养琼脂培养基(批号，050328)，改良马丁琼脂培养基(批号，010315)，营养肉汤培养基(批号，041010)，PH7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液(批号，050217)

    1.4菌种 大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(F)44102]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003](中国药品生物制品检定所提供)。

    2 方法验证

    微生物限度检查的验证实验按中国药典2005版微生物限度检查法(附录ⅪJ)常规法和薄膜过滤法进行。

    2.1菌液制备 取上述经34℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10^-5～10^-7备用；取经24℃培养18～24h的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml.加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10^-5备用；取经培养一周的黑曲霉菌斜面物，加0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊后，取1ml加入0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10^-4备用。

    2.2菌液的检验 取上述金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌10^-5～10^-7稀释液各1ml，用45℃营养琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，30～35℃培养48h，计数，应约为50～100cfu/ml；取上述白色念珠菌10^-5～10^-6稀释液及上述黑曲霉菌10^-4孢子悬液各1ml，用45℃琥红琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，23～28℃培养，逐日观察计数，应约为50～100cfu/ml。结果见表1。

    2.3供试液制备 取样品10g，加pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100ml，混匀，取适量3000转/分离心10min作为1:10的供试液。

    2.4回收率的测定

    2.4.1细菌数霉菌数常规法测定试验组：取1:10供试液1ml、50～100cfu试验菌同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72h逐日观察结果。菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数(同菌液检验)。供试品对照组：取1:10供试液1ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72h逐日观察结果，测定供试品本底菌数。

    2.4.2细菌数薄膜过滤法测定 取1:10的供试液1ml，注入开放式滤器(先用少量缓冲液润湿滤器)，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次100ml共4次(总冲洗400m1).加1ml(50～100cfu)试验菌，抽干后，取出滤膜菌面朝上贴入规定琼脂平板培养基中，置规定温度培养48h，结果见表2。

    2.5回收率的计算 按如下公式计算试验组的加菌回收率：回收率＝(试验组一供试品对照组)÷菌液组×100%

    2.6控制菌检查方法的验证

    2.6.1常规法 取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述大肠埃希菌液1ml，置35℃培养24h；取稀释液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基，置35℃培养24h.作为阴性对照；取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述金黄色葡萄球菌液1ml，置35℃培养24h，作为阴性菌对照组。另取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中.同时加入上述大肠埃希菌液1ml.置35℃C培养24h；取稀释液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中置35℃培养24h，作为阴性对照；取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中，同时加入上述金黄色葡萄球菌液1ml，置35℃培养24h，作为阴性菌对照组。

    2.6.2稀释法 取1:10供试液10ml加入200ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述大肠埃希菌液1ml，置35℃培养24h；取稀释液10ml加入200ml胆盐乳糖培养基，置35℃培养24h，作为阴性对照；取1:10供试液10ml加入200ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述金黄色葡萄球菌液1ml，置35℃培养24h，作为阴性菌对照组。

    3 结果

    从表2结果可以看出：该供试品接种5株阳性试验菌株，常规法对枯草杆菌、白色念珠菌回收率均低于70%，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌回收率均高于70%；薄膜过滤法对枯草杆菌、白色念珠菌回收率均高于70%。说明该样品具有抑菌活性，细菌数、霉菌数、酵母菌均需采用薄膜过滤法进行测定。见表3。

    4 结论

    从表2～3结果可以看出，通过接种5株阳性试验菌株，经方法学验证，细菌数、霉菌数、酵母菌均需采用薄膜过滤法进行测定；控制菌大肠埃希菌需采用稀释法进行检查。

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