淡竹叶清热作用药效植物基础研究

【摘要】  　　目的研究淡竹叶清热作用有效部位及化学成分，为淡竹叶的进一步开发利用和质量标准的制定提供科学依据。方法采用体外抑菌实验筛选淡竹叶有效抑菌部位，并采用HPLC-MS法分析抑菌部位的化学成分。结果淡竹叶甲醇提取部位具有抑菌作用，根据液质联用图谱及文献，分析鉴定出淡竹叶甲醇提取部位中6个化学成分，分别为香草酸、香豆酸、牡荆苷、苜蓿素7-β-D-葡萄糖氧基黄酮、芦竹素或其同分异构体白茅素及苜蓿素。结论淡竹叶甲醇提取部位具有一定的抗菌活性，对各菌种的抑菌效果有较大差异，这一部位可能与淡竹叶清热解毒功效相关。采用HPLC-MS法分析鉴定有效部位化学成分，保留了液相色谱与质谱兼具的微量、快速的优点,结合了前者的高分离效能与后者的准确性及选择性的特点,方法稳定可靠，为淡竹叶的进一步开发利用和质量标准的完善提供科学依据。 
【关键词】  中药鉴定 淡竹叶 抑菌实验 液质联用
　　Abstract：ObjectiveTo investigate the effective part and components of Heat-cleaning in Herb Lophatheri,and to provide scientific accord for further development and establishment of quality specification of Herb Lophatheri.MethodsScreen effective antiblastic part by bacteriostasis experiment in vitro,and analyze the chemical compositions with HPLC-MS in this part.ResultsThe part extracted with MeOH was effective bacteriostasis,6 components were detected by HPLC-MS atlas and relative articles in it.They were vanillic acid,coumaric acid,vitexin,Tricin7-β-D-glucosyloxy-flavone,arundoin,and Tricin.ConclusionThe part extracted with MeOH has antibacterial activity,and the activities are different to different bacterium,this part may be correlated with heat-cleaning and detoxicating in herb Lophatheri. HPLC-MS has good quality of both HPLC and MS,it is stable and reliability, and can provide sciencic proif for further development and improvement of quality specification of herb Lophatheri.
　　Key words：Authentication of Chinese medicines;  Herb lophatheri;  Bacteriostasis experiment;  HPLC/MS/MS
　　淡竹叶为禾本科植物淡竹叶Lophatherum gracile Brongn. 的干燥茎叶［1］。始载于《本草纲目》，1977年以来的历版《中国药典》均有收载，具有清热除烦、利尿的功效。用于热病烦渴，小便赤涩、淋痛，口舌生疮。淡竹叶为卫生部公布的药食两用中药之一，近年来多有制成保健凉茶［2］、淡竹叶酸奶［3］等。
　　淡竹叶的有效成分物质基础研究一直较为薄弱，现有化学成分的研究显示淡竹叶主含黄酮、三萜类、多糖、酚性成分、氨基酸、有机酸及多种微量元素等［4～6］。依据现代医学理论，结合淡竹叶的中医临床功效，本实验对淡竹叶不同溶剂的提取部位进行了抑菌活性的研究，对淡竹叶清热有效物质基础进行初步筛选，并运用液质联用分析手段对所筛选的部位进行化学成分分析，为淡竹叶的进一步开发利用和质量标准的制定提供科学依据。
　　1   仪器与材料
　　1.1   仪器手提式压力蒸气灭菌器（上海华线医用核子仪器有限公司）；移液枪（北京金花移液器厂）；HPLC－MS/MS液质联用仪（Water’s公司，型号Quattro Primer，产地：美国）。
　　1.2   菌株
　　大肠杆菌 CMCC(B) 44103；金葡菌CMCC(B)26003；乙链菌CMCC（B）32210；绿脓菌CMCC(B)24430。
　　1.3   药物营养琼脂（国药集团化学试剂有限公司，批号F20040304）；肉汤培养基（国药集团化学试剂有限公司，批号20060310）；血琼脂基础（国药集团化学试剂有限公司，批号20060228）；葡萄糖肉汤（国药集团化学试剂有限公司，批号10010518）；香草酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号110776－200402）。牡荆苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号11876－200501）。淡竹叶采于江苏省宝华山，经南京中医药大学鉴定教研室吴启南教授鉴定为禾本科(Gramineae)植物淡竹叶Lophatherum gracile Brongn.的干燥茎叶。
　　2    方法与结果
　　2.1   不同提取部位抑菌实验
　　2.1.1   提取部位制备
　　淡竹叶置于多功能提取罐，60％乙醇回流提取5 h，提取液减压回收溶剂得到淡竹叶总浸膏，总浸膏与硅藻土拌匀，分别加入石油醚、二氯甲烷、甲醇、水逐级超声提取，减压回收溶剂，得石油醚提取部位、二氯甲烷提取部位、甲醇提取部位和水提取部位，作为供试品。
　　2.1.2  不同提取部位抑菌实验取上述供试品各1 g，加入蒸馏水1 ml，超声溶解。在超净工作台上将灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中，待冷却凝固后，用无菌移液管吸取1∶1 000稀释的大肠、金葡、绿脓菌液加到平皿上，用刮铲将菌液涂匀，再用打孔器在培养基上打孔，打孔后每个孔内注入25 μl药液，37℃培养24 h，观察实验结果。结果见表1。表1  淡竹叶不同提取部位抑菌实验结果（略）
　
    从药敏实验中发现，淡竹叶的石油醚、二氯甲烷及水提取部位对该3种细菌抑菌效果为阴性，甲醇提取部位对该3种细菌抑菌效果为阳性，故对甲醇提取部位的抑菌效果做进一步的实验。

2.2  甲醇提取部位抑菌实验
　　2.2.1  对金葡菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的抑菌实验将甲醇提取部位的浸膏配成相当于生药浓度为40，20，10，5，2.5，1.25，0.625 g•ml-1。同“2.1”项下方法实验，制作培养基，将菌液涂匀于培养基上，打孔，分别注入20 μl的药液，37℃培养，24 h后观察抑菌结果。结果见表2。表2  不同浓度甲醇提取部位对3菌种抑菌圈直径平均值（略）
　
　　从表2中我们可以看出淡竹叶甲醇提取部位对金葡菌、绿脓杆菌和大肠杆菌均有一定的抑菌效果，抑菌效果依次为：绿脓杆菌>金葡菌>大肠杆菌，但都属于低敏的范围。
　　2.2.2  甲醇提取部位对乙链球菌的抑菌实验将提取部位按照浓度为10，5，2.5，1.25，0.625 g•ml-1制作血平板，加入乙链球菌，放入37℃温箱培养24 h，次日观察实验结果。
    结果显示，5 g•ml-1以下均有乙链球菌生长，故淡竹叶甲醇提取部位对乙链的抑菌最小浓度为10 g•L-1。
　　2.3  淡竹叶甲醇提取部位化学成分液质联用分析
　　2.3.1    供试品制备取浙江产淡竹叶20 g，氯仿回流提取脂溶性物质至无色，药渣再用甲醇回流提取至无色，溶液蒸干热水溶解，离心，上清液过大孔树脂，弃去水液与20％乙醇液，收集75％乙醇溶液，减压回收溶剂至干，甲醇定容于5 ml容量瓶中，作为供试品溶液。
　　2.3.2    分析条件色谱条件：色谱柱为 C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）；流动相为A（乙腈），B（水，0.05%甲酸）；梯度：0→15 min，A：5%→70%；B：95%→30%；流量0.5 ml•min-1；进样量2μl；柱温40℃；柱后分流后进入质谱仪。
　　质谱条件：电离源为ESI+；检测方式为正离子模式；毛细管电压为3.0 kV；锥孔电压为30 V；离子源温度为120℃；扫描范围为m/z 150～600；氮气流量为400 L•h-1。
　　2.3.3   样品分析将供试品溶液分别放入自动进样器中，按选定的测试条件，进行检测，得供试品的总离子流色谱图，结果见图1。
　
　　2.3.4  总离子流色谱图中化合物的鉴定根据MS所测定的［M+H］+ 值及质谱图谱，通过检索文献［4～6］及部分标准品对照，鉴定出6个化合物，分别为香草酸、香豆酸、牡荆苷、苜蓿素7-β-D-葡萄糖氧基黄酮、芦竹素和苜蓿素。结果见表3。表3  甲醇提取部位中化学成分鉴定结果（略）
　
　　3  讨论
　　淡竹叶抑菌实验结果表明，甲醇提取部位对大肠杆菌、金葡菌、绿脓杆菌均有一定的抑菌作用，其中对绿脓杆菌的作用较强，对大肠杆菌的作用较弱；对乙链球菌也有一定的抑菌作用，其最小抑菌浓度为10g•ml-1。淡竹叶具有一定抑菌作用，但抑菌作用不强，根据这一结果，分析淡竹叶的临床清热作用，可能存在其它的作用机制，如增强免疫功能等。
　　本文首次运用HPLC-MS法对淡竹叶中有效抑菌部位（甲醇提取部位）的化学成分进行了深入分析研究，根据质谱图谱，参考现有淡竹叶化学成分研究的文献，并部分采用标准品对照等方法，初步鉴定出甲醇提取部位中的6个化学成分分别是香草酸、香豆酸、牡荆苷、苜蓿素7-β-D-葡萄糖氧基黄酮、芦竹素和苜蓿素。现有研究结果表明，香草酸、香豆酸具有抗菌消炎作用，牡荆苷具有抗炎解痉与降压活性，对大肠杆菌有抑制作用。从总离子流色谱图中可以看出，淡竹叶甲醇提取部位中所含的成分十分复杂，由于淡竹叶化学成分的基础研究薄弱，一些量大的化合物如相对保留时间为tR0.95 min，tR4.15 min，tR4.65 min，tR6.81 min等色谱峰还未能鉴定，有待进一步研究。
　　本文研究结果初步确立了淡竹叶中清热解毒成分，主要是有机酸、黄酮和三萜类化合物，为淡竹叶质量标准的完善和提高奠定了实验基础。
【参考文献】
  　　［1］国家药典委员会．中国药典，Ⅰ部［S］ ．北京：化学工业出版社，2005：230.

　　［2］靳桂敏，廖文通．苦瓜、金银花、淡竹叶复合保健饮料的研制［J］ ．现代食品科技，2006，23（2）：37.

　　［3］马亚宁, 吕嘉枥, 李娟萍．淡竹叶酸奶的研制［J］ ．食品研究与开发，2007，128（3）：96.

　　［4］陈 泉, 吴立军，王 军，等．中药淡竹叶的化学成分研究［J］．沈阳药科大学学报，2002,19 (1)：23.

　　［5］陈 泉， 吴立军，阮丽军．中药淡竹叶的化学成分研究( II)［J］．沈阳药科大学学报，2002,19 (4)：257.

　　［6］中国医学科学院药物研究所．中草药有效成分的研究［M］．北京：人民卫生出版社，1972：441.

 

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