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【摘要】 从高活性菌株到获得高产量活性产物之间，发酵是一个重要环节。本研究设计4种内生菌发酵培养基，对89株分离自傣药植物且具有高抗菌活性的内生菌及5株潜在放线菌新种进行摇瓶发酵，发酵液的提取物用3种展层系统作薄层色谱(TLC)展层，用UV(254nm、366nm)和茴香醛试剂进行检测。实验结果表明，用1号和4号培养基发酵产生的次生代谢产物的种类最丰富，2号和3号培养基产生的较少；用II号展层系统(氯仿∶甲醇=4∶1)和III号展层系统(正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5)作TLC层析，检测到的产物最多；3种检测方法以茴香醛检测到的代谢产物最丰富。对每一株菌而言，产生最多产物的发酵培养基各不相同，为了获得尽可能多的次生代谢产物，不同菌株选用的发酵培养基不一样。探究适合的发酵培养条件，为活性产物的分离、制备奠定了基础。
【关键词】 植物内生菌； 发酵培养基； TLC
ABSTRACT Fermentation of 89 endophytes and 5 novel species candidates of actinomycetes were carried out by four different fermentation media. Three developing systems were used for chromatography of TLC. UV 254nm, 366nm and anisaldehyde as a chromogenic agent were used for detecting compounds of these strains. Results indicate that the metabolites of these strains were the most abundant when these strains were fermented in No.1 and No.4 media, and only few in No.2 and No.3. Metabolites of each strain were different in different media. More metabolites could be detected when the TLC was carried out in system II (chloroform∶methanol=9∶1) and system III (butanol∶acetic acid∶water=4∶1∶5) with anisaldehyde test solution. These result established a base for designing of fermentation medium, isolation and purification of effective compounds for discovery of new leader compounds from endophytes.
KEY WORDS Plant endophytes; Fermentation medium; TLC
至今已描述的放线菌达40个科、180多属、4000多种［1］，从中发现的生物活性物质达11000种之多［2］，目前临床和农牧业上应用的抗生素有60%以上是放线菌生产的。当今要从普通环境微生物发现新的生物活性物质越来越困难，其中去重复就是一道难题［3］。但是，自然界仍然存在至少90%以上的未知微生物［2，4～6］，其中植物内生菌越来越受人们的重视［7］。为了充分利用云南丰富的植物内生菌资源，从中发现更多的新活性物质，近3年我们从云南西双版纳采集50科、96属的傣药植物样品123份，分离到内生菌1673株，用7种作物病原菌、4种肿瘤细胞模型，筛选到抗菌、抗肿瘤高活性菌株230株。从高活性菌株到获得高产量活性产物之间，发酵是一个重要环节。本文对89株植物内生菌和5株放线菌潜在新种的发酵培养基进行了初步研究。
1 材料和方法
1.1 菌种
从云南西双版纳傣药植物分离筛选到89株抗肿瘤、抗作物病原菌的高活性内生菌菌株，其中50株放线菌、10株真菌、29株细菌；另外有5株具有抗菌活性的放线菌潜在新种，共94个菌株。
1.2 斜面培养基
真菌 PDA固体培养基［8］。
细菌和放线菌 酵母膏
复合维生素 维生素B1 1mg，维生素B6 1mg，核黄素1mg，烟酸1mg，苯丙氨酸1mg，维生素H 1mg，丙胺酸0.3mg［10］。
微量盐 FeSO4·7H2O
1.3 发酵培养基
1号培养基 黄豆粉
2号培养基 可溶性淀粉
3号培养基 葡萄糖
4号培养基 大豆粉
将菌种接种于斜面培养基，
1.4 发酵样品提取物制备
发酵液加入等体积95%乙醇，
1.5 TLC分析
用毛细管点样于硅胶GF254薄层板上，用三种展层体系和三种检测条件进行分析。
1.6 三种展层体系
I：氯仿∶甲醇(9∶1)；
II：氯仿∶甲醇(4∶1)；
III：正丁醇∶乙酸∶水(4∶1∶5，用上层)。
1.7 三种检测条件
选取常用的254nm荧光淬灭成像检测、366nm荧光成像检测和具有广谱性的茴香醛硫酸溶液显色检测。茴香醛硫酸溶液(母液)：乙醇∶冰乙酸∶浓硫酸(85∶10∶5)；100ml母液加入1ml茴香醛。
1.8 HPLC分析
甲醇溶解的样品用0.45μm孔径的滤膜过滤，10μl进样于HPLC仪。色谱柱为Zorbax Eclipse XDBC18(
1.9 仪器与试剂
真空冷冻干燥机为英国Edwards公司产品；薄层数码成像仪为瑞士CAMAG公司Repostar 3型产品；高效液相色谱仪为美国Agilent 1100系列；薄层硅胶GF254板为青岛海洋化工厂生产。所用试剂均为分析纯。
2 结果及讨论
由于实验菌株发酵后所产生的有效成分尚不清楚，因此从菌株生长情况和产生的化合物条带的多少初步评判发酵培养基的好坏。
2.1 菌株生长情况
94株菌在4种发酵培养基中均能生长，在1号和4号培养基中的生长比在2号和3号培养基中生长得好。
2.2 TLC检测结果
94株菌的4种发酵液提取物，采用标准化程序：三种展层体系展层和三种检测条件的TLC分析，薄层扫描仪扫描、储存(统计结果见Fig.1和Tab.1)、检索比较后，将存在未知化合物的产生菌作为进一步实验的材料。
后产生的代谢产物条带数目明显多于2号和3号；4号培养基产生的代谢产物条带总数又多于1号培养基，3号培养基所检测到的数目最少。例如，94个菌株用4号培养基发酵提取物，用氯仿∶甲醇(4∶1)展层，254nm、366nm、茴香醛检测的结果，分别共有387、346、394个条带，1号培养基分别有297、303、300个条带，而3号培养基仅有81、142、198个条带。
在相同的展开体系和检测条件下比较Rf值，结果显示，相同菌株在不同的培养基中产生不完全相同的条带，尽管4号培养基产生的化合物条带最多，但其它培养基也能产生一些4号培养基不能产生的化合物。也就是说，同一个菌株在不同培养基的发酵产物是不一样的。
通过不同菌株4种培养基发酵产物的TLC结果比较，94株菌中有49株在1号培养基中产生的代谢产物条带最多，42株在4号培养基中最好，另外3株为2号培养基。本实验的放线菌(包括5个潜在新种)、真菌、细菌用4种培养基发酵的结果同样是1、4号培养基的条带多于2、3号(Tab.2)，但每一株菌产生最多产物的培养基各不相同。所以，为了获得尽可能多的代谢产物，不同菌株的发酵培养基应有所不同。
Tab.3是用1、4培养基发酵，产生产物较多的10株菌的检测结果。可以看出，1号培养基有3株的条带在10条以上，4号培养基只有1株产生8个条带，1株7个条带，3株6个条带。
2.3 不同展层系统、不同检测条件的效果
3种展层系统的极性从小到大。Tab.1和Fig.1的结果表明，各个展层系统的展层效果明显不同。II系统(氯仿∶甲醇=4∶1)在三个系统中属中等极性，检测到的条带最多，总条带有3039个；I系统(氯仿∶甲醇=9∶1)有2708个，III系统(正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5)只有2616个。不同的检测条件检测到的结果
2.4 HPLC检测结果
选取部分菌株样品进行HPLC检测，结果显示，不同菌株产生的次生物质存在明显差异，相同菌株在不同培养基中也存在一定的差异。在254nm波长的检测条件下，用1号培养基发酵后产生的产物比其它培养基发酵产生的产物多，结果与TLC检测结果相对应。Fig.2为具有高抗菌活性的植物内生放线菌菌株YIM 48790(Dactylosporangium属的潜在新种)和YIM 56167采用1号培养基发酵后的次生代谢产物。图中明显看出，两株放线菌通过1号培养基发酵后产生了大量次生代谢产物，代谢产物的组成也大不一样。
3 讨论
89株植物内生菌、5株放线菌潜在新种采用4种培养基进行发酵，三种检测方法检测，所获得的结果表明，不同培养基产生的代谢产物各不相同。52%(49株)的菌株用1号培养基发酵，产生的代谢产物条带总数最多；44%的菌株用4号培养基发酵条带最多。但每一株菌产生最多产物的培养基各不相同。同一个菌株在不同培养基发酵的产物种类也不一样，1号培养基成分最单一，便于化合物的提取、纯化，且成本低廉；4号培养基成分比较复杂，不利于以后化合物的分离纯化。所以1号培养基是一种比较理想的发酵培养基，可
Fig.2 HPLC chromatography of 2 actinomycete
strains at 254nm以在筛选时用于大量菌株的发酵。三种检测条件中，茴香醛检测法获得的总条带最多，也可供选用。这些结果为设计适合的发酵培养条件、检测方法以及活性产物的分离、制备奠定了基础。
在微生物生物活性物质研究中，无论TLC检测还是HPLC检测，和其它现代仪器的检测都是可行的途径，但特别要注意实验条件的标准化，确保数据的准确性，同时要建立相应的数据库，使数据储存、检索、查寻、分析程序化。
发现新的先导化合物是开发天然药物的重要关键之一［11］，高活性菌株、新菌种提供了发现新产物的可能性。要实现这种可能性，发酵是重要环节。过去对植物内生菌、极端环境微生物、海洋微生物培养条件的研究不多，但这些微生物是很有开发潜力的资源，应该重视这方面的研究，为发现新先导化合物提供技术支持
【参考文献】
［1］ Bérdy J. Bioactive microbial metabolites, a personal review ［J］. J Antibiot,2005,58(1):1～26.
［2］ 徐丽华，李文均，刘志恒，等. 放线菌系统学［M］. 北京：科学出版社，2007.
［3］ 姜怡，徐平，娄恺，等. 放线菌药物资源开发面临的问题与对策［J］. 微生物学通报，2008，35(2)：272～274.
［4］ Hughes J B, Hellmann J J, Ricketts H, et al. Counting the uncountable: Statistical approaches to estimating microbial diversity ［J］. Appl Environ Microbiol,2001,67(10):4399～4406.
［5］ Zengler K, Toledo G, Rappé M, et al. Cultivating the uncultured ［J］. PNAS,2002,99(24):15681～15686.
［6］ Joseph S J, Hugenholtz P, Sangwan P, et al. Laboratory cultivation of widespread and previously uncultured soil bacteria ［J］. Appl Environ Microbiol,2003,69(12):7210～7215.
［7］ 姜怡，杨颖，陈华红，等. 植物内生菌资源［J］. 微生物学通报，2005，32：146～147.
［8］ 黄秀梨. 微生物学实验指导［M］. 北京：高等教育出版社，1999.
［9］ Shirling E B, Gottlieb D. Methods for characterization of Streptomyces species ［J］. Int J Syst Bacteriol,1966,16:313～340.
［10］ Hayakawa M, Nonomura H. Humic acidvitamin agar, a new medium for the selective isolation of soil actinomycetes ［J］. J Ferment Technol,1987,65:501～509.
［11］ 刘志恒. 放线菌微生物药物的重要资源［J］. 微生物学通报，2005，32(6)：143～145.
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