论文摘要:采用正交实验设计,对一种富集光合细菌的培养基进行优化,试验结果表明:酵母膏和NaHCO3在培养基中的浓度对富集红螺菌科的光合细菌有显著的影响。若以达到相同生长量(OD660值)做指标,应用优选出来的培养基进行富集比原培养基要提前5~6 d。
光合细菌(PSB)是一大类能进行光合作用的原核生物的总称。研究应用的实践表明,光合细菌中的红螺菌科能利用多种硫化物和有机物作为其光合作用的供氢体和有机碳源,在高浓度的有机废水处理与资源化、水产养殖的水质调控与促进健康生长、在农业中作为高效活性菌肥等方面,发挥着十分有益的和令人瞩目的作用[1]。光合细菌的推广和应用,需要合适的培养基质,但目前经典的用于富集红螺菌科光合细菌的培养基(小林达治1977)[2]平均富集的时间为2~8周,且存在培养基成分种类多,成本较高的缺点。为此,笔者在教学实践中,对其进行应用型优化设计,旨在为高活性光合细菌的推广应用提供一定的帮助。
1 材料和方法
1.1 样品和菌种来源
光合细菌样品来自湛江港岸潮间带表层沉积物、湛江湖光岩附近奶牛养殖场和鸭塘的污水和底泥中。共分离出3种红螺菌科菌株:沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)、红螺菌(Rhodospirillumsp.),沼泽红假单胞菌为优势菌群,故选沼泽红假单胞菌为本试验菌种。
1.2 培养基
富集培养基采用《微生物学实验教程》[2]中配方:氯化铵0.1 g,碳酸氢钠0.1 g(5%水溶液,过滤除菌取2 ml加入),磷酸氢二钾0.02 g,乙酸钠0.1~0.5 g(取0.3 g),七水硫酸镁0.02 g,氯化钠0.05~0.2 g,(取0.2 g)生长因子1ml,微量元素溶液1ml,蒸馏水97 ml,pH 7.0。
1.3 方法
1.3.1 富集培养基的初步优选
1.3.1.1 NaHCO3利用试验 在试验过程中发现:适当的提高NaHCO3浓度,可缩短富集的时间。为探索其中量的关系,笔者做如下试验设计:取灭菌的富集培养基以250 ml/瓶装入医用点滴瓶中,上铺一层无菌液体石蜡, NaHCO3过滤除菌后依比例0.1%,0.15%,0.2%,0.25%,0.3%加入。每种培养条件做2个重复。沼泽红假单胞菌(7.4×108个/ml)接种量为2%, 30℃,3000 lx光照强度下连续培养6d,每天在660 nm处测定其光密度OD值,以不加碳酸氢钠的培养基接种做对照。
1.3.1.2 酵母膏对光合细菌生长的影响 红螺菌科光合细菌生长需要硫胺素、生物素等生长因子。为此,在培养基中添加一定量的酵母膏能促进光合细菌生长。将富集培养基中的生长因子和微量元素溶液分别用蒸馏水替代,酵母膏分别以0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%,0.25%添加。同1.3.1.1接种培养3 d后,测定其OD660值。
1.3.2 改良培养基组成成分的正交试验设计[3]为研究NaHCO3和酵母膏浓度对富集培养基的综合效应及和作为氮源的NH4Cl有无交互作用,采用L8(27)正交试验设计(如表1),富集培养基100 ml,去除其中的生长因子和微量元素溶液
1.3.3 优化培养基的确立分别从湛江港岸潮间带表层、湛江湖光岩附近奶牛养殖场及鸭塘取淤泥、污水若干。50 g淤泥及100 ml污水装入500 ml具塞磨砂广口瓶,每个样品4瓶。2瓶添加200 ml改良的富集培养基,另外2瓶添加原富集培养基。搅拌均匀后,加入灭菌的液体石蜡以隔绝空气。25~35℃下用5000~10000 lx(距40 W白炽灯15~50 cm)的光照强度连续培养18 d,观察记录两种富集培养基富集培养过程中光密度(OD660)变化。
2 结果与分析
2.1 富集培养基的初步优选结果
2.1.1 NaHCO3利用试验
随着NaHCO3浓度的增加,菌株到达稳定生长期的时间缩短。NaHCO3浓度<2%时,菌体生长浓度随NaHCO3浓度增加而增大。2%时,光密度值最大。说明此时光合细菌的生长条件最为适合(见图1)。
2.1.2 酵母膏利用试验
随着酵母膏浓度的增加,光合细菌菌体生长浓度逐渐增大。当培养基中酵母膏的浓度为0.1%时,其菌体生长浓度和添加0.15%酵母膏时的生长浓度无显著性差异,从经济角度考虑,选择0.1%酵母膏较好(见图2)。
2.2 正交实验结果
从方差分析表结果可以看出:A因素(NaHCO3)和C因素(酵母膏)的主效应是主要影响因素。酵母膏的含量对富集试验结果的影响要更大一些。NaHCO3作为添加的碳源,和作为氮源的酵母膏、NH4Cl之间的交互作用都很小。培养基合适的C/N是微生物进行正常生长繁殖的前提,从极差分析很容易选出最优水平是A2B1C2,即改良培养基的NaHCO3含量为2.0 g,酵母膏含量为1.0 g,其他条件不变。从以上分析得出优选培养基:氯化铵0.1 g,碳酸氢钠0.2 g(5%水溶液,过滤除菌取4 ml加入),磷酸氢二钾0.02 g,乙酸钠0.1~0.5g(取0.3 g),七水硫酸镁0.02 g,氯化钠0.05~0.2 g(取0.2 g),酵母膏0.1 g,蒸馏水96 ml,pH 7.0。
2.3 优化培养基的验证结果
两种富集培养基富集培养结果见图3~图5。由图可见:海滩污水样品中光合细菌使用改良富集培养基12 d培养液转红色(OD660=0.321),而原富集培养基富集培养液转红色(OD660=0.329)在第18 d出现;鸭塘污水中光合细菌使用改良培养基富集11 d培养液转红色(OD660=0.326),而原富集培养基富集培养液转红色(OD660=0.329)则在第16 d出现;奶牛场污水中光合细菌使用改良培养基富集11d培养液转红色(OD660=0.339),而原富集培养基培养液转红色(OD660=0.339)则在第16 d出现。使用改良培养基从3个地点(海滩、奶牛场、鸭塘)样品中富集光合细菌比原培养基提前5~6 d。
3 讨论
NaHCO3在富集光合细菌过程中有很大的作用。①用于调整培养液的pH。对于异养型光合细菌,一般使用5%的NaHCO3把pH调节到7.0~8.0。②NaHCO3产生的CO2在细菌营养代谢中具有重要作用。首先,CO2能与有机酸结合,生成多羧基酸,在三羧酸循环中起重要作用[4]。其次,CO2能促进荚膜细菌荚膜的形成,推测其可促进荚膜红假单胞菌的增殖[5]。③富集培养相对于分离培养所用的时间较长,加大作为碳源的碳酸氢钠的用量能延续增长光合细菌的数量,这点对于第一次富集培养尤为重要;但是NaHCO3不能加得过多,这是因为NaHCO3会导致培养液碱化而不利于光合细菌的生长;NaHCO3是富集螺旋藻等其他藻类的主要营养成分。加量过多,促进藻类繁殖,光合细菌富集会受到影响。
酵母膏对光合细菌的生长有明显的刺激作用。这主要是由于酵母膏的营养丰富,含有光合细菌所需要的各种生长因子。酵母膏浓度在0.25%以内对菌体繁殖速度有很大的影响,但浓度过高,容易染菌,不利于分离[6]。
光合细菌是国内外致力于开发的微生物资源,在水产养殖业中具有去除NH4+和NO2-,改善水质,提高鱼饲料营养,促进鱼、虾生长发育的功效。光合细菌的推广应用需要合适的培养基质,本试验根据细菌的生长速度和产量来看,改良培养基效果良好。但能否是最佳方案,还需进一步研究。
参考文献:
[1] 徐亚同,史家粱,张明.污染控制微生物工程[M].北京:化学工业出版社,2001. 204-211.
[2] 钱存柔,黄仪秀.微生物学实验教程[M].北京:北京大学出版社, 2001.212.
[3] 杜荣骞.生物统计学[M].北京:高等教育出版社,1985.476.
[4] 陈天寿.微生物的培养基的制造与应用[M].北京:中国农业出版社,1995.21.
[6] 郭庆文,吉海平.紫色非硫光合细菌的研究[J].饲料工业,1994 ,15 (3):36-39.
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