海博微信公众号
海博天猫旗舰店
海博微信公众号
海博天猫旗舰店
自从1882年Koch发现结核杆菌以来，为促进结核杆菌生长，缩短培养时间，达到提前分离、鉴定的目的，人们对结核杆菌的营养、生理代谢及人工培养进行了一系列的研究，经过一个多世纪的不懈努力，已经对结核杆菌的生长规律有了比较深入地了解，并且形成了许多成熟的培养方法。尽管现代分子生物学技术在结核病研究中发挥着越来越重要的作用，但是结核杆菌的培养在结核病的诊断、流行病学指标、结核菌的分型鉴定、药敏试验、结核病药物的研究等方面依然有着不可替代的作用。为了能够较系统地了解、有针对性地选择合适、恰当的培养基，本文就国内外较为成熟的培养基种类及应用进行如下综述。
1 按培养基的性状分类
培养结核杆菌的培养基，从性状上分主要有固体培养基、液体培养基、半流体培养基、固液双相培养基等类型，这些培养基各有特点。
1.1 固体培养基 最常用的是罗氏（Lownstein-Jenson，L-J）培养基，也是最具代表性的一种，其他的还有小川辰次（Tatsujiogawa）鸡蛋培养基和Middle brook 7H10、7H11等琼脂培养基等。在固体培养基中，由于可以直接观察菌落的形态并可做鉴别用，因此常用于临床标本的分离培养、鉴别、保存菌种及对抗结核药物的敏感性测定等方面，缺点是结核菌生长缓慢。
1.2 液体培养基 常用的有苏通（Sauton）培养基、Middle brook 7H9等液体培养基。结核杆菌在液体培养基中能够更广泛的接触营养成分，因此在液体中生长相对较快,主要在液体表面生长，搅动时下沉至管底，可获得大量的结核杆菌。主要缺点是：在对临床标本的收集、采样、运输方面有不利的一面；不能根据肉眼观察菌落形态；培养基污染机会多，影响结核杆菌的生长，污染时不易与结核杆菌鉴别，需涂片染色镜检判断结核杆菌是否生长。
1.3 半流体培养基 改良苏通半流体琼脂培养基是一种人工综合培养基，基质透明，呈半流体状态，生长的结核杆菌形成白色颗粒状菌落悬浮于培养基中段，便于观察。
1.4 固液双向培养基 Septi-Check AFB双相培养基是国外应用较早的一种培养基［1］，采用BD专利式封闭式固液双相一体化培养基设计。液相为Middle brook 7H9分枝杆菌专用增菌培养基，可迅速繁殖分枝杆菌，固相为3种固体培养基平面：Middle brook 7H11和改良的L-J培养基用于及时将增菌肉汤内分枝杆菌进行分离纯化以获得单个菌落，巧克力琼脂用于早期发现污染菌，避免时间浪费。由于有液相作为基础，因此结核杆菌生长较快，也是一种非常有效的培养基。国内有用平菇制备的平菇双相培养基［2］是利用平菇浸出液为基础，加小牛血清、琼脂等成分而配制的一种培养基，根据琼脂的量不同制成液相、固相培养基。在国内应用较少，主要特点是成本低，制备简单，适合于基层使用，有一定的研究价值。
2 按成分分类
主要分为以鸡卵和琼脂为基础的两种培养基［3］。为了使结核杆菌达到快速生长的目的，可加上血液、椰汁、平菇液等不同营养成分，从而配制出各种不同的培养基。
2.1 以鸡卵为基础的培养基 有L-J培养基、Ogawa培养基、丙酮酸钠培养基和丙酮酸钠细胞色素C培养基等。在鸡卵为主的培养基中，鸡卵液是关键成分，在制备培养基时，要充分考虑鸡卵液的新鲜程度以及营养成分是否受到破坏。
2.2 以琼脂为基础培养基 包括苏通（Sauton）培养基Middle brook 7H9、7H10、7H11、7H12，匡氏培养基Proskauer培养基和Beck琼脂培养基等。这些培养基主要是由无机盐类及一系列的有机化合物等成分组成。琼脂的作用主要是赋形剂，通过调整琼脂的量，一方面可以制备成不同性状的培养基；另一方面，在液体培养基中的少量琼脂有利于结核杆菌在中段形成菌落，从而便于观察。
3 按目的分类
在前述的培养基基础上，根据研究目的不同，加入特定物质后，可以制备成用于快速培养、鉴别、药敏等不同用途的培养基，主要为了满足临床的需要。
3.1 用于快速培养 主要有Becton Diskinson（BD）公司研制的系列全自动培养系统和Organon Teknika公司研制开发的培养系统。其的还有Difco公司ESP系统、生物梅里埃公司的VITAL系统等。由于与现代先进的仪器设备、技术结合，检测灵敏度高，时间短，但通常价位较高。
20世纪70年代末，BD公司研制的培养系统主要有早期的BACTEC 460TM TB，成为全球第一台专业的全自动分枝杆菌培养鉴定仪，该系统培养基以Middle brook7H12为基础，在培养基中加入标记
MB/BacT分枝杆菌培养系统是由Organon Teknika公司开发的，将血液培养中判断细菌生长的pH指示剂用于结核杆菌的培养。结核杆菌代谢中产生的CO2变化通过化学感受器监测，利用酸碱度的变化使pH指示剂颜色改变，最后通过发射光度计检测颜色变化。其平均检测时间比LJ早2周。该系统依然采用Middle brook 7H9液体培养基，当有阳性信号时，需取培养液进行涂片及鉴定确认。
Difco公司ESP系统,是一种全自动的血培养系统，可以连续监测细菌的生长。具有无放射性的特点，与BACTEC TB 460比较［11，12］，在检测时间上差异无显著性,可以替代使用，Williams-Bouyer N等将ESP与BACTEC MGIT 960进行了详细比较［13］，在整体检测时间上稍长些，对戈登分枝杆菌监测率高。作为一种液体培养基,需要与固体培养基结合使用,而不能作为一种独立系统。
我国学者根据国内具体情况，利用血液、椰汁、植物激素、平菇液、豆浸液等不同营养成分，配制成多种不同的快速培养基。如用平菇制备的平菇双相培养基，在落实培养基基础上的豆浸液培养基、植物激素培养基等。
3.2 用于选择 由于结核杆菌生长缓慢，且营养要求高，因此对于其他的微生物极易生长，通常在培养基中都加有抑菌物质。在罗氏培养基中，微量孔雀绿既可抑制杂菌的生长，又可对结核杆菌的生长有促进作用。Gynft通过把孔雀绿的浓度提高，同时加入青霉素、萘啶酸制备成选择性的改良罗氏培养基［14］。在Middle brook 7H10、Middle brook 7H11的基础上，通过加上多黏菌素B、羧苄青霉素C、两性霉素B和三甲氧氨嘧啶即可制备成结核菌素的选择培养基，其目的主要是为了减少污染率，提高阳性率。
3.3 用于鉴别 最主要的有（对硝基苯甲酸）和TCH（噻吩-2-羧酸）鉴别培养基。用溶解稀释后，在制备L-J培养基的同时，加入二甲基甲酰胺或丙二醇制成PNB培养基，加入噻吩-2-羧酸制成TCH培养基，用于结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的初步鉴定［15］。
3.4 用于药敏 匡氏培养基是由我国研制的一种在结核杆菌快速药敏试验中有很好价值的培养基［16］。虽然BD公司的产品能够快速的检测结核杆菌，并且在药敏方面也有一定的优势，但早期的培养系统存在放射性，新开发的培养系统又存在污染率较高的问题，而在传统的含药罗氏培养基上存在抗结核药物受热失活和蛋白质吸附两个主要问题至今尚未解决，而匡氏培养基的优点在于不存在高蛋白组分对药物的吸附作用，又无加热凝固等造成药物失活问题，因此在药敏试验方面有着显著的优越性。主要由无机盐、维生素、琼脂、甘油和小牛血清等成分组成。药敏试验报告结果比罗氏培养基平均早29天，多数药敏结果可在3周内报告，对结核病的临床治疗有重要指导意义。BACTEC系列培养系统、ESP系统等都可用于药敏试验，一些液体培养基（苏通培养基和胆固醇液体培养）可用于中草药对结核杆菌抑菌试验。
3.5 用于L型细菌的培养 结核杆菌L型的营养基本上与原菌相同，但一般需要加入一定量的渗透压稳定剂和血清，国外主要使用的培养基［17］有巯基醋酸盐培养基、PPLO琼脂、VSY肉汤和高桥的胰腺大豆蛋白陈琼脂培养基(TSA-I)等。国内庄玉辉等［18］已成功地利用改良TSA-L培养基培养L型菌。此外安徽蚌埠医学院的L型液体培养基(代号92-3TBL)，培养15天后可取沉渣镜检。
在结核杆菌的培养研究中出现过很多培养基，以上介绍的是国内外通用的一些培养基，有许多新出现的培养基虽然培养时间缩短，但同时出现问题也很多，因此要慎重选择。另外，要用一种培养基同时达到多种目的也是很困难的，因此许多实验室多同时应用几种培养基，以便于从各个角度来满足临床和科研的需要。总之，只要结核病还威胁着人类的健康，对培养基的研究还将继续下去，但是如何深入、细致地研究现有培养基各成分的相互作用及如何使现代生物技术与传统培养技术更好的结合等问题还有待于进一步的研究。
【参考文献】
1 Isenberg HD, D’Amato RF, Heifets L, et al. Collaborative feasibility study of a biphasic system(Roche Septi-Chek AFB)for rapid detection and isolation of mycobacteria. J Clin Microbiol,1991, 29(8):1719-1722.
2 申建维，袁玮，李娉，等.平菇双相培养基用于结核杆菌培养的研究.中国防痨杂志，2001，23（4）：241-244.
3 Saito H. Laboratory media for the cultivation of tubercle bacillus. Kekkaku,1998,73(5):329-337.
4 WHO. Laboratory services in tuberculosis control,1998.
5 David Lubasi, Charity Habeenzu, Satoshi Mitarai. Evaluation of an ogawa mycobacterium culture method modified for higher sensitivity employing concentrated samples. Tropical Medicine and Health,2004,32(1):1-4.
6 张敦熔.现代结核病学.北京：人民军医出版社，2000,17-19.
7 闻玉梅.现代医学微生物学.上海：上海医科大学出版社，1999，507.
8 Hanna BA, Ebrahimzadeh A, Elliott LB, et al. Multicenter evaluation of the BACTEC MGIT 960 system for recovery of mycobacteria. J Clin Microbiol,1999,37(3):748-752.
9 Chien HP, Yu MC, Wu MH, et al. Comparison of the BACTEC MGIT 960 with Lowenstein-Jensen medium for recovery of mycobacteria from clinical specimens. Int J Tuberc Lung Dis,2000, 4(9):866-870.
10 kos Somoskvi, Csaba Kdmn, kos Lantos, et al. Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Lowenstein-Jensen medium. J Clin Microbiol,2000,38(6):2395-2397.
11 Woods GL,Fish G, Plaunt M, et al. Clinical evaluation of difco ESP culture system Ⅱ for growth and detection of mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology,1997,35 (1): 121-124.
12 Enrico Tortoli, Paola Cichero, M Gabriella Chirillo, et al. Multicenter comparison of ESP culture system Ⅱ with BACTEC 460TB and with lowenstein-Jensen medium for recovery of mycobacteria from different clinical specimens, including blood. Journal of Clinical Microbiology,1998,36(5): 1378-1381.
13 Williams-Bouyer N, Yorke R, Lee HI, et al. Comparison of the BACTEC MGIT 960 and ESP culture system Ⅱ for growth and detection of mycobacteria. J Clin Microbiol，2000,38(11):4167-4170.
14 闫国蕊，苏保亮.结核病细菌学检验技术.郑州：郑州大学出版社，2001，9：32.
15 中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程.中国防痨杂志，1996，18（1）：28-31.
16 匡铁吉，董梅，张青霞，等.匡氏琼脂培养基用于痰结核菌直接药敏试验的效果研究.中国检验医学与临床，2002,3（2）：54-56.
17 王进.结核分支杆菌L型的研究现状.中华新医学，2003，4（19）：1774-1776.
18 庄玉辉，李国利，张小刚，等.肺结核病人L型分离培养方法的研究.微生物学通报，1991，18（6）：348.
