聚合酶链反应-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种

作者：李国利  庄玉辉  赵铭  王国治  陈保文  沈小兵  胡忠义  

摘　要　目的　建立一种简便、快速、敏感和特异的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法　以16SrDNA为靶序列，采用聚合酶链反应(PCR)-反向斑点杂交检测25种分枝杆菌、11种非分枝杆菌标准株、10株分枝杆菌临床分离株和26份临床痰标本。结果　分枝杆菌、非分枝杆菌标准株经DNA扩增，分枝杆菌均出现578 bp DNA片段，非分枝杆菌除假白喉棒状杆菌可见同样片段外，其余菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出100 fg结核分枝杆菌DNA。探针特异性试验表明，17种寡核苷酸探针除pTub1、pFor1、pSme探针可见交叉杂交外，其余探针均是特异的。10株结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌临床分离株PCR-反向斑点杂交结果与常规鉴定结果相符。26份涂片阳性痰标本经该法直接鉴定为结核菌复合体。结论　16SrDNA pCR-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种快速、有效，具有较高的应用价值。

　　关键词：分枝杆菌，结核；聚合酶链反应；DNA探针

　　目前，国内外所采用常规的分枝杆菌菌种鉴定方法，操作复杂、费时，根据细菌生物学表型特征，采用十几项指标综合分析，需1～2个月方可获得种的鉴定结果，难于满足临床诊断及治疗的要求。迫切需要建立快速、可靠的分枝杆菌菌种鉴定方法。我们采用16SrDNA pCR-反向斑点杂交技术，快速鉴定分枝杆菌菌种，具有较高的应用价值。

　　材料与方法

　　一、材料

　　1.菌株及标本来源：试验所用25种分枝杆菌标准株(图1)、11种非分枝杆菌标准株(表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、假白喉棒状杆菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、卡他布兰汉菌、大肠埃希菌、星形奴卡菌、红色红球菌)来源于中国药品生物制品检定所和中国科学院微生物研究所。4株结核、6株非结核分枝杆菌临床分离株和26份临床痰标本，分别来源于上海市疾病预防控制中心和本院结核科。临床分离株已依据《全国结核病诊断细菌学检验规程》^［1］常规方法菌种鉴定。26份痰标本涂片抗酸染色分别为+～++++。

　　2.16S rDNA引物及寡核苷酸探针：根据已知的各种分枝杆菌菌种16S rDNA序列片段及文献报道^［2-4］设计引物及17种分枝杆菌寡核苷酸探针。引物Ⅰ(5′端地高辛标记)和引物Ⅱ之间包括了16s rDNA 578 bp片段。引物及探针序列见表1。由上海生工生物工程有限公司合成。

　　二、方法

　　1.探针加尾：100 μl反应体系内5X末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应缓冲液20μl，dTTP终浓度1 mmol/L，探针终浓度2 μmol/L，TdT 80 U，加双蒸水至100μl，混合后稍离心，置37℃水浴2 h，加0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)2 μl终止反应。

　　2.DNA提取及PCR扩增：参照文献［5］提取标准菌株、临床分离菌株及临床痰标本DNA。在25μl反应体系内PCR扩增，10X PCR buffer 2.5 μl，引物Ⅰ、引物Ⅱ终浓度各为0.2μmol/L，4xdNTP终浓度各为0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，DNA模板10～20 ng或临床痰标本DNA提取物2.5 μl，加双蒸水至25 μl。置热循环仪内94℃1 min，55℃2 min，72℃ 2 min，共40个循环。72℃延伸7 min，2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

表1　16srDNA引物及寡核苷酸探针序列

　　3.反向斑点杂交：(1)制膜：取加尾后的探针4～6 pmol按顺序点于硝酸纤维素膜上，置60℃干烤固定2 h。固定后的膜经漂洗去除未固定的探针，可立即使用，也可待干燥后保存待用。(2)杂交：点有加尾探针的膜放入反应袋中。将地高辛标记的PCR产物煮沸5 min，冰浴5～10 min。在各反应袋中分别加入杂交液(5×SSC，1% blocking试剂，0.1%十二烷基肌氨酸钠，0.02%SDS) 5 ml，再分别加入变性的PCR产物10～15μl，混匀，闭膜，55℃孵育30 min。(3)洗膜：洗液Ⅰ(2×SSC，0.1%SDS)室温10 min洗2次，洗液Ⅱ(0.1×SSC，0.1%SDS)55℃10 min洗1次。(4)抗体结合：按说明书稀释抗地高辛抗体-碱性磷酸酶结合物(Anti-Digoxigenin-AP)，与杂交后的膜室温作用30 min。(5)洗膜：缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.5)室温洗膜2次，每次10 min，缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl₂，pH9.5)室温洗膜1次，5 min。(6)显色：用BICP-NBT系统显色，待DNA显色，未出现本底时，用TE洗膜终止反应。结果

　　1.16S rDNA引物PCR的特异性及敏感性：引物Ⅰ和引物ⅡPCR扩增所试分枝杆菌和非分枝杆菌标准菌株，经琼脂糖凝胶电泳后分枝杆菌均可见一条578 bp DNA带，而非分枝杆菌，除假白喉棒状杆菌可见该DNA带外，其余均未见扩增带，表明用引物Ⅰ和引物Ⅱ扩增分枝杆菌16S rDNA有较好的属特异性。取经定量的结核分枝杆菌H₃₇RV株DNA依次稀释为1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg及1 fg/μl DNA，取1 μl DNA扩增，其检测敏感性为100 fg。

　　2.16S rDNA寡核苷酸探针特异性：25种分枝杆菌标准株PCR扩增后反向斑点杂交结果见图1。探针pMyc与所试分枝杆菌均杂交；探针pTub2、pKan与相应的复合体菌种杂交；探针pAvi、pInt、pScr、pMar、pSzu、pXen、pGor、pFor2、pChe、pTer、pNon只与相应菌种杂交。探针pTub1与土分枝杆菌和金色分枝杆菌、pFor1与不产色分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、pSme与微黄分枝杆菌可见交叉杂交。11种非分枝杆菌标准株扩增产物与17种分枝杆菌探针均不杂交。

　　3.临床分离株及临床标本检测：采用PCR-反向斑点杂交检测经常规方法鉴定的4株结核分枝杆菌、6株非结核分枝杆菌(偶发分枝杆菌1株、堪萨斯分枝杆菌2株、胞内分枝杆菌3株)临床分离株，除1株常规方法鉴定为胞内分枝杆菌，PCR-反向斑点杂交试验鉴定为鸟分枝杆菌外，其余菌株鉴定结果相符合。

　26份抗酸染色阳性痰标本直接进行PCR-反向斑点杂交试验，鉴定为结核分枝杆菌复合体。

　　讨论

　　细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成^［6］。其分子内存在的可变区，显示出细菌不同分类等级水平上的特异性。目前，国外关于分枝杆菌16S rDNA片段序列信息研究较多^［3］，包括了临床标本可见到的多种分枝杆菌菌种。

　　我们最初试验中选择的pTub1、pFor1除与相应菌种杂交外，与其他分枝杆菌可见杂交。交叉杂交可能是由于种特异探针与其他分枝杆菌菌种16S rDNA相应区之间错配核苷酸数量少造成的。此外，错配的位置可能也影响结果，例如，土分枝杆菌PCR产物与pTub1有3个核苷酸错配，与该探针杂交，而海分枝杆菌PCR产物与pTub1仅有2个核苷酸错配，但与该探针并无杂交，海分枝杆菌PCR产物和pTub1错配核苷酸之间间隔有6个核苷酸，而土分枝杆菌PCR产物与pTub1错配核苷酸之间间隔则是11个核苷酸，文献报道^［4］配对核苷酸连续长度达到10个以上即可产生交叉杂交。因此我们重新设计了pTub2和pFor2，提高了检测的特异性。pKan为堪萨斯-胃-瘰疬复合体探针，与堪萨斯、胃、瘰疬分枝杆菌均杂交，这是由于pKan选择于16SrDNA可变区A区内，该探针与此区内堪萨斯、胃、瘰疬分枝杆菌相应DNA序列相同，故试验同时在16s rDNA可变区B区内设计了瘰疬分枝杆菌探针pScr，瘰疬分枝杆菌与pKan和与pScr均杂交，堪萨斯-胃分枝杆菌复合体只与pKan杂交，据此我们可以将其相互鉴别。胃分枝杆菌虽与pKan杂交，但胃分枝杆菌为非致病性分枝杆菌，且胃分枝杆菌为不产色菌，堪萨斯分枝杆菌为光产色菌，我们可以参照菌落色素的不同，对两者进行鉴别。鸟、胞内分枝杆菌同属RunyonⅢ群分枝杆菌，生物学表型特征极为相似，常规方法很难区别，多称其为鸟-胞内分枝杆菌复合体。我们根据DNA遗传信息差别设计的寡核苷酸探针，可以将两者鉴别。

　　在实际应用中，可先将pMyc与pTub2联合使用，初步将结核与非结核分枝杆菌鉴别开，如疑为非结核分枝杆菌，再用一系列特异探针进行菌种鉴定。该方法为PCR与探针技术相结合，不仅可用于分离菌株及早期液体培养物鉴定。其最大的优点是可用于临床标本的直接检测及鉴定。我们用26份抗酸染色阳性痰标本的初步试验，证明该方法是可行的，在接收标本后48 h内即可报告结果，我们将继续深入研究该方法的应用价值。

　　作者单位：李国利(100091北京，解放军第三○九医院结核中心研究室)

　　庄玉辉(100091 北京，解放军第三○九医院结核中心研究室)

　　赵铭(100091 北京，解放军第三○九医院结核中心研究室)

　　王国治(中国药品生物制品检定所)

　　陈保文(中国药品生物制品检定所)

　　沈小兵(中国药品生物制品检定所)

　　胡忠义(上海市疾病预防控制中心)

　　参考文献

　　1，中国防痨协会.全国结核病诊断细菌学检验规程. 中国防痨杂志，1996， 18：80-85.

　　2，Patel S, Yates M, Saunders NA. PCR-enzyme-linked immunosorbent assay and partial rRNA gene sequencing: a rational approach to identifying mycobacteria. J clin Microbiol, 1997, 35: 2375-2380.

　　3，Kirschner P, Springer B, Vogel U, et al. Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence determination: report of a 2-year experience in a clinical laboratory. J Clin Microbiol, 1993, 31: 2882-2889.

　　4，Kox LFF, Leeuwen J VAN, Knijper S, et al. PCR assay based on DNA Coding for 16S rRNA for detection and identification of mycobacteria in clinical samples. J Clin Microbiol, 1995, 33: 3225-3233.

　　5，李国利，庄玉辉，张晓刚，等. PCR快速检测肺结核痰标本结核杆菌的评价.中华流行病学杂志，1992， 13(特刊2号): 169-171.

　　6，尚世强，洪文澜，俞惠民，等. 细菌DNA的聚合酶链反应扩增及反相杂交初步分型.中华医学检验杂志，1998，21：281-284

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