葡萄组织培养（1）

一、葡萄的形态特征和生物学特性

葡萄（Vitis　vinifera　L．）属落叶木质藤本植物，葡萄地上部分的茎细长柔弱，髓部较大，组织较疏松。节上具有卷须，使新梢可以缠绕其它树木或支架上向上攀援。叶近圆形或卵形，35裂，基部心形。圆锥花序。葡萄是深根性作物，其根系在土壤中的分布状况，随气候、土壤型，地下水位、栽培管理方法的不同而发生变化。但在大多数情况下，根系垂直分布最密集的范围，是在20～80 cm的深度内，但在不同的栽培管理条件下，根系的分布也将随着发生变化。

葡萄的根富于肉质，髓射线发达，能贮藏大量的有机营养物质，如糖、蛋白质和单宁等。葡萄的枝蔓上很容易产生不定根，故在生产上多采用扦插法繁殖。在大气潮湿的情况下，枝蔓上往往长出气生根。

葡萄原产于温带地区，不太抗寒。葡萄的根系抗寒力很弱，大部分欧洲种葡萄的根系在－5～－7℃时即受冻，某些美洲种能忍受－11～－12℃左右的低温。

葡萄在全世界的果品生产中，产量及栽培面积一直居于首位。其果实除作为鲜果食用外，主要用于酿酒，还可制成葡萄汁、葡萄干和罐头等加工品。葡萄不仅味美可口，而且营养价值较高。成熟的浆果中含有15～25％的葡萄糖和果糖以及多种对人体有益的矿物质和维生素。

二、葡萄的组织培养－茎尖的分化与生长

（一）分离接种

从田间生长旺盛的葡萄新梢顶端取1～2cm的茎尖。除去幼叶后在5%次氯酸钠溶液中浸泡2～3分钟，消毒灭菌，以后用无菌水冲洗3次，再在0．1%升汞溶液中浸泡约2min，以后用无菌水冲洗四次。在无菌条件下分离出约2mm长的茎尖，接种到培养基上。

（二）培养基

葡萄茎尖分化培养基以MS培养基（无机盐减半为好），再添加BA1～2，NAA0．01，LH100，蔗糖2%，琼脂0．6%，而B5培养基愈伤组织化严重，茎尖生长不好。

（三）茎尖的分化

葡萄1～2mm茎尖接种后成活率皆较高（表12－1），只有法国兰品种为56．4%，白雅等品种皆在72．6%以上，而友谊、白雅等品种的成活率达到百分之百。

表12－1　葡萄茎尖接种成活率

接种成活的茎尖一个月左右开始分化幼叶和侧芽，两个月左右，由于侧芽的不断增生，形成芽丛。由于不同品种对BA和NAA的反应不同，故生长有明显区别，巨峰、大粒白香蕉、赤霞珠等品种，由于顶端优势强，侧芽生长势弱，故增殖率低，但成苗率高；白羽、白雅、白谢希、贵人香等大多数品种侧芽分生能力强，可在幼茎上多次分枝，故成苗率低；2号大白粒等个别品种，则幼茎短缩膨大呈球形，很难成苗。

（四）茎尖苗的生长

在茎尖分化培养中产生的成苗率低和成苗困难，密集生长的芽丛，可将分化培养基中的BA浓度减低至0．5，同时添加GA30．2，则经一个月的培养，就可长成2～3cm高的幼茎。此外黑暗处理对幼茎的伸成，提高成苗率，也有明显的效果。

表12－2　黑暗处理对葡萄白羽品种芽丛成苗的影响

（五）生根与移栽

切取2～3cm长的茎尖苗，接种到MS+ IAA0 ．4+NAA0．05培养基中，进行生根培养，其中添加和琼脂0．4%，1～2周后幼苗开始生根，一个月形成完整的根系，同时具备5～6片新叶，生根率一般在90%以上。

移栽时洗去根上的培养基，栽到蛭石内，使根系具良好的通气条件，种后盖上塑料薄膜，经7～10d锻炼适应后可去掉，移栽成活率也达90%左右。

（六）注意事项　提高葡萄试管苗移栽成活率要注意：①幼苗生长要健壮；②要保持空气湿度；③根际通气要良好；④要尽量减少杂菌污染；⑤浇灌的溶液浓度不能过高。

三、葡萄无病毒苗的培养(Culture of Disinfected Seedling)

（一）培育意义

葡萄受到26种病毒的危害。由于病毒的危害，葡萄的长势减弱，产量降低，果实的糖分含量减少，风味变劣。葡萄卷叶病是危害最大的病毒病，在不同品种上表现不同，但多数叶片变红，自基部起向内卷，似革质增厚，粗糙易脆；有的叶脉绿色，叶肉黄色；有的品种则表现矮化。此病可减产10～50%，造成果实糖分含量降低，成熟期推迟两周，紫葡萄果色会变绿。

现在已广泛应用茎尖组织培养和热处理结合的方法来培育园艺植物无病毒苗。而葡萄的茎尖培养脱毒利用还不十分普遍，这是因为葡萄也可通过简易的热处理法来得到无病毒植株。但茎尖脱毒的方法也兼有短期大量快速繁殖的作用，所以应用上具有很大的意义。

（二）热处理脱毒

热处理可以有不同的方法：

1．葡萄无性系处理材料置于38℃，CO21200ppm的人工气候箱内。经30min处理，较易从枝条尖端或休眠芽中除去扇叶病毒。卷叶病毒则处理3个月或更长时间也难以除去。黄点病毒处理11个月也无效。

2．将感染材料的休眠芽插入健康指示植物的蔓中，然后在38℃的环境中保持两个月，以后取出枝条和接种芽继续生长。

3．直接将葡萄蔓浸泡在50℃的温水中10～20min，可以治疗皮尔斯病，但不能治疗黄点病及卷叶病。

（三）组织培养脱毒技术

茎尖组织培养脱毒要经过七个时期：A为茎尖接种后的变绿增大期；B为形成畸形叶期；C为形成许多芽和芽的伸长期；D为许多芽展开小叶和小叶伸长期；E为诱导发根期；F为地上部和地下部的伸长期；G为上盆期。

图12－1　茎尖脱毒培养各期生长示意图

1．茎尖接种后变绿、增大期的培养

从被病毒感染的植株上取材，在5℃下冷藏保存。以后在25℃，相对湿度80%，16h的长日照条件下水培。再从长出的新芽经消毒后切取茎尖进行培养，大小约0.2～0.3mm（带一个叶原基）。

以MS培养基作基本培养基，不能添加GA3，否则培养的茎尖大部分黄化，生成膨软的组织，一转移就完全损失。试验结果以1/2MS，添加NAA0．1，BA1．0，KT0．5，腺嘌呤4．0，蔗糖30g/L，琼脂6．0，pH5．8为好。培养的茎尖的率最低，仅13．3%，1mm以上能生长的个体也最多，达88．6%。

2．从A到D（茎叶伸长期）

处于变绿、增大期的茎尖如继续在上述培养基进行继代培养。不仅不生长，最后还会枯死。据研究，只要将原来培养基中的NAA0．1，改换为IAA0．2，即采用1/2MS，添加IAA0．2，BA1．0, KT0．5，腺嘌呤4．0，蔗糖30克/升的培养基。则有34．1%的茎尖可生长到达畸形叶期（B期）。

在上述培养基对从 B期到较多芽的形成及伸长期（C期），同样是适合的，有 76．7％的茎尖可生长到C期。从 C期到茎叶伸长期（D期）则应将上述培养基中的BA和蔗糖浓度各降低一半，即采用1/2MS，添加IAA0．2mg/L，BA0．5 mg/ L，KT0．5 mg/ L，腺嘌呤4 mg/ L ，蔗糖 15g／L的培养基。有 94．4％茎尖的茎叶皆能很好生长。

3．从D期到地上和地下部的生长期（F期）

为诱导生根，将2cm左右的芽切下，转入 Galzy（1964）培养基，添加 NAA0．1 mg/L，经60天的生长，发根率可达89．8％，而地上部也进行生长的只占10．2％。为促进地上部也同时进行生长，在诱根培养20天，根长0．5cm米左右时转入无激素的Galzy （1964）培养基，则有 73．7％的植株地上和地下都可以同时生长，经1个月培养，地上都可达4～5cm，叶数可达5片左右。

4．从F期到上盆（G期）

从培养瓶中取出苗时要注意绝对不要伤根，将琼脂冲洗掉，以后种在以蛭石为基质，直径6 cm的塑料盒中。栽培在温度15～25℃，光照强度3000Lx，光照时间为一天16h，相对湿度80％的锻炼室中进行。约培育20天，地上部开始伸长，发绿，则可移至通常的温室中进行隔离栽培。

5．无病毒苗的大量繁殖

处于D期的材料，茎叶常集中在一起，成为丛状，可以一个个进行分离，再接种到1／2MS，添加 IAA0．2 mg/ L ，BA1 mg/ L，KT0．6mg/ L ，腺嘌呤 4mg/ L，蔗糖 15g／L的培养基，即能形成大量新芽，以后转入上述培养基中只BA减为0．5 mg/ L 的培养基，即可使小叶展开、伸长，得到植株。这样反复继代培养，可繁殖得到大量的无病毒苗。

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