葡萄组织培养（2）

（四）葡萄无病毒苗的鉴定和生产

从组织培养得到的葡萄无病毒苗，要经过指示植物法等鉴定途径，确认无病毒存在，才可以繁殖生产，推广应用。

葡萄卷叶病毒尚无草本寄主。常用芽接指示植物，品种有Baco、Mission和Ln－33，其中以Ln－33反应较灵敏，有的每株嫁接后当年秋天发病，而 Mission需经四年才表现症状。Ln－33易繁殖，易嫁接，抗霜霉病，无自然感染的黄点病，嫁接后只表现温和症状，是现有的最好指示植物。葡萄黄点病指示植物有Ln－33、Baco－22A、Esparte和Mission，其中Esparte是最好的指示植物，春天嫁接，第二年秋天即出现症状。

经过鉴定确实无病毒，则应建立葡萄种苗库，由生产单位、技术部门分工协作，进行系统的选育、检验和生产（图12－2）。

　四、葡萄花粉（pollen）的培养

（一）葡萄花粉植株的培养

Gresshoff等（1974）进行了欧亚种葡萄（Vitis　vinifera）的花药培养，得到了单倍体愈伤组织。Hirabayashi等（1976）则研究了不同培养基和不同培养条件对花粉愈伤组织新梢分化的影响，发现在0～30℃的自然温度，在NitSCh培养基培养，则有新梢和根的分化。邹昌杰等（1981）研究了9个葡萄品种的花粉培养工作，从其中一个品种分化得到了植株。

（二）培养方法

取花粉单核靠边期的花药，该期的外部标志为花穗上密集的小花刚开始分离，而花穗上退化叶叶尖未变褐时进行接种。自田间取来的花穗先用自来水冲洗，以后在70％酒精中浸15s，再在饱和漂白粉澄清液中消毒7min，无菌水冲洗3次后接种。以后暗培养，控温26＋l℃。

诱导培养基为改良B5添加BA2mg／L，2，4－D0．5 mg／L ，蔗糖3％，琼脂0．6％。分化培养基为改良B5添加BA 4mg／L ，NAA0．2mg／L ，蔗糖2％，琼脂0．6％。成苗培养为MS（大量减半），添加BA 0．1 mg／L ，NAA（或1AA）0．01 mg／L，蔗糖 1～2％，琼脂0．4％，PH值6．0。

花药接种后 3d陆续变褐色（加活性炭的不变），接后12d可见花药裂口处长出愈伤组织，20～30d为生长旺期。产生的愈伤组织可按其颜色和质地分三类：甲类白色，质地紧密而脆，球形，表面有颗粒状突起；乙类白色，疏松，球形不规则，有些品种呈红色；丙类淡黄色，松软，生长迅速，易老化。

（三）愈伤组织的诱导

1．不同品种的培养　邹昌杰等（1977）进行了17个葡萄品种夏梢花药的诱导培养对比，愈伤组织的诱导率以巴娜蒂品种为最高，可达49．7％，其次红香蕉为49．2％，而蜜尔紫品种的诱导率仅为3．75％。这是由材料本身的内在因素所决定的。

2．春梢和夏梢花的培养　葡萄具有一年多次开花的习性，这给花药培养提供了更多的培养机会。但由于春梢和夏梢生长的季节不同，故材料素质也不一样，不同的品种表现也

不尽相同。如红香蕉以春梢愈伤组织诱导率为高达47．1％，白莲子则以夏梢为高，达20．8％（春梢由于花粉已过单核靠边期，可能有一定的误差存在）。

3．不同细胞分裂素的影响　从BA和KT不同细胞分裂素对葡萄不同品种（品系）花药愈伤组织诱导培养的效果看，总的以BA的效果为好，大多品种诱导频率皆较高，特别是甲类愈伤组织的诱导率皆显著优于KT。

4．椰乳的效果　培养基中添加椰乳对提高愈伤组织的诱导率有明显的作用，皆可提高一倍左右。8％与12％相比以8％为优，所以添加量太大也无益。

4．植株的分化

在葡萄胜利品种花药诱导（诱导率为17．1％）中产生一种质地硬而脆，表面大，颗粒状，外形不规则，稍加外力易成碎块，见光后迅速变绿的愈伤组织，增殖慢。以后转移到分化培养基，出现器官分化。

愈伤组织开始分化时，先在表面产生半透明的胶状物，即分化大量的胚状体，又分化少数肉质芽。胚状体长至3～5mm时，转入成苗培养基，连续光照数昼夜变绿，逐渐长成植株。肉质芽包埋在愈伤组织内，如早期剥离培养，也能长成完整植株。

为使愈伤组织分化，只加入低剂量的细胞分裂素，无需生长素。但在加有高剂量的细胞分裂素和低剂量生长素的培养基上也能分化。

五、子房培养 (Ovary　Culture)

葡萄的子房培养无论对葡萄基础生理的研究和园艺方面的应用皆有一定意义。

Nakagawa等（1983）进行了葡萄子房培养的试验，研究了一些生长影响因子。

（一）分离培养　取开花前两天的花，经灭菌后，小心地去掉花冠和雄蕊，而不要伤害子房，用小刀将子房从基部切下，接种到Nitsth培养基上。培养室保温25℃，光照强度为2500Lx，每天照明12小时。

（二）有机添加物的作用? 有机添加物对培养子房的发育皆有促进作用，依其作用大小依次为麦芽提取液、鲜葡萄汁、黄瓜汁和葡萄蔓叶。发现有的子房接种到鲜葡萄汁，几周后会变褐死亡。

（三）生长调节物质的作用

葡萄子房培养在添加有植物生长调节物质的培养基中，可以促进单性生长，并在培养15周后在有些处理观察到浆果变色的情况。

从培养子房的体积看，在基本培养基中添加有 BA0．2mg／L的处理，要超过对照（无激素）。子房体积最大的为添加BA 0．2mg／L、NAA 0．2 mg／L、GA31 mg／L及NAA、GA3、 BA三种激素的皆比对照小。

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