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【摘要】 目的 了解临床分离大肠埃希菌耐环丙沙星gyrA基因突变情况。方法 用环丙沙星浓度梯度法试条检测临床分离大肠埃希菌最低抑菌浓度（MIC），聚合酶链反应(PCR)扩增gyrA基因喹诺酮耐药决定区，扩增产物片段长度为668 bp，用限制性内切酶HinfⅠ消化PCR产物，行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果 共检测大肠埃希菌41株，14株MIC在0.25～0.5 μg／ml的菌株，未检出耐药性突变位点；4株MIC在1～2 μg／ml的菌株（2株MIC为1μg／ml、1株为1.5 μg／ml，1株为2 μg／ml）均出现gyrA基因突变；耐药菌23株（1株MIC为16 μg／ml，其余≥32 μg／ml）也均发生gyrA基因突变。结论 临床分离大肠埃希菌对环丙沙星耐药性与HinfⅠ酶切位点突变密切相关，低水平耐药菌株gyrA基因发生突变具有一定临床意义。
A gyrA gene mutation in clinical Escherichia coli Zhang Junmin, Wu Jian, Zhao Liping, et al. Department of Microbiology, the General Hospital of PLA, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To study a gyrA mutation of clinical E.coli strains.Methods We used Ciprofloxacin Etest to detect the MIC values of clinical E.coli strains, then PCR to amplify the quinolone-determining region (QRDR) of the gyrA gene, and digest the PCR products (668 bp) with HinfⅠ and 8% polyacrylamide gel electrophoresis.Results Fourty-one strains of E.coli were detected. Fourteen strains with MIC 0.25～0.5 μg/ml exhibited no gyrA mutation, but 4 strains with MIC 1～2 μg/ml and 23 strains with MIC 16～23 μg/ml gyrA gene mutation.Conclusion There was a close relationship between the clinical quinolone-resistant E.coli strains and the loss of HinfⅠ sits in gyrA gene. The gyrA gene mutation found in low-level Ciprofloxacin resistant E. coli will be useful to manage these resistant strains.
【Key words】 E.coli Ciprofloxacin gyrA gene Mutation
近年来临床分离大肠埃希菌对喹诺酮类耐药性的显著上升趋势，引起了临床和微生物实验室的广泛关注。编码DNA旋转酶的gyrA或gyrB基因发生点突变被认为是产生耐药性的主要原因［1］。用聚合酶链反应(PCR)－限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)检测大肠埃希菌gyrA基因突变位点，是一种简便、易行的方法［2］。为此，我们利用此方法对临床分离大肠埃希菌gyrA基因突变情况进行了研究，现将结果报告如下。
材料与方法
一、材料
1.菌株：临床分离大肠埃希菌41株：23株为耐药菌，其中1株环丙沙星最低抑菌浓度(MIC)为16 μg／ml，其余22株MIC≥32 μg／ml；2株MIC分别为1.5 μg/ml和2 μg／ml；敏感菌16株，其中14株MIC在0.25～0.5 μg／ml，2株MIC为1μg／ml。同时也检测大肠埃希菌ATCC 25922。
2.环丙沙星浓度梯度法试条、药敏用培养基均为AB Biodisk产品。试条MIC结果按美国临床试验室标准化委员会1996年标准判断。环丙沙星MIC≤1μg／ml为敏感，MIC≥4μg／ml为耐药。
二、方法
1.DNA提取：按文献［3］进行，不做RNA消化，DNA溶于0.5ml TE缓冲液中待用。
2.PCR反应扩增：喹诺酮耐药决定区(QRDR)引物按文献［2］，引物1为5′-GAGGAAGAGCTGAAGAGCTCCT-3′，引物2为5′-CCGGTACGGTAAG-CTTCTTCAA-3′，由中国科学院微生物研究所基因工程中心合成。PCR体积25 μl：Tris-HCl 10 mmol/L，pH9.0、KCl 50 mmol/L、MgCl2 2.5 mmol/L、Triton X-100 0.1％、4×dNTPs各200 μmol/L北京宝秦克生物科技公司产品；引物0.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶1UPromega公司产品。DNA模板5 μl。93℃预变性5分钟，93℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟，共40个循环。最后72℃再延伸6分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳。
3.HinfⅠ酶切分析：方法按文献［4］进行，反应总体积20 μl：2 μl 10×反应缓冲液、10 μl PCR扩增产物、6 μl无菌水、2 μl HinfⅠ限制性内切酶（6U／μl，北京北方同正生物技术发展公司产品），8 000 r／min离心30秒，放37℃作用4小时，取10 μl消化产物行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，150V电压1.5小时。放含0.5 μg／ml溴化乙啶的1×TBE缓冲液染色30分钟，观察结果并照相。
结果
用PCR方法对41株大肠埃希菌及大肠埃希菌ATCC 25922QRDR进行扩增，经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实，均扩增出一条片段长度为668 bp的产物。
对上述扩增产物用限制性内切酶HinfⅠ消化后行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见附图。电泳结果显示环丙沙星MIC在0.25～0.5 μg／ml的大肠埃希菌及标准菌株，酶切后均为3条DNA带，表明这些菌株的HinfⅠ酶切位点未发生突变；而2株MIC为1 μg／ml的菌株、2株中介度的菌株以及所有耐药菌株，HinfⅠ酶切后则为2条DNA带，表明该酶切位
1：pBR322DAN/HinfⅠ；2：大肠埃希菌ATCC 25922；MIC依次：3号0.25，4号0.5，5号1，6号1.5，7号2，8号16，9、10、11号≥32 μg/ml
附图 大肠埃希菌QRDR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳点发生突变。
讨论
喹诺酮类抗菌药物如环丙沙星等因其抗菌谱广等优点，在临床得到广泛应用。但随着这类药物的应用，耐药菌也在不断增加，其中以大肠埃希菌耐药性增加最为显著［3］。我们分离的大肠埃希菌对环丙沙星耐药率从1994年的41.9％上升至1997年的60.4％。而其他肠杆菌科常见细菌如阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌等1997年耐药率还不到12％。而从泌尿系感染病人分离的菌株，耐药率又较非泌尿系感染病人高。从1994年的55.1％上升至1997年的73.8％。造成这一现象的原因主要与近年来喹诺酮类药物的大量使用及不合理应用，引起抗生素介导的选择性耐药突变有关［5］。
大肠埃希菌对环丙沙星产生耐药性是由染色体介导的，这包括与DNA旋转酶（DNA gyrase）合成有关的结构基因如gyrA和gyrB，以及与细胞膜通透性或药物排泄能力有关的调控基因发生突变，均可导致大肠埃希菌对环丙沙星产生不同程度的耐药性［1］。Yoshida等［6］报道gyrA基因单位点突变可导致大肠埃希菌对喹诺酮类耐药，突变发生在gyrA N末端氨基酸67～106范围内，称为QRDR。Fisher等［7］证实gyrA基因中密码子83(有时可能是82)发生突变常常造成大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物耐药，该位点的突变可用限制性内切酶HinfⅠ酶切证实。这一方法简便易行，在研究其他细菌耐喹诺酮类gyrA基因突变中也有应用［8］。我们也是利用这一原理对大肠埃希菌gyrA基因进行突变位点检测。
大肠埃希菌gyrA基因发生单位点突变时，仅对环丙沙星低水平耐药，而这部分菌株一般用常规检测MIC方法难以检出，在抗菌药物进一步作用下极易发展成高水平耐药［1］。我们用浓度梯度法Etest法所测菌株中，所有耐药菌gyrA基因均检出突变位点。而2株敏感菌（MIC为1 μg／ml）及中介度的2株菌也出现了HinfⅠ酶切位点丢失，即gyrA该位点突变。这4例病人仅进行了一次微生物学检查，我们无法了解这几株菌gyrA基因突变前的药敏变化情况，以及我们检出gyrA基因发生突变后是否演变成了高水平耐药。但我们的结果表明，常规药敏方法检测的部分敏感菌或处在中介度的菌株出现gyrA基因突变，应引起临床及实验室足够重视。用常规方法检出这部分菌株，对控制低水平耐药大肠埃希菌发展成对环丙沙星高水平耐药菌有一定意义。
有关低耐大肠埃希菌HinfⅠ酶切位点发生突变后，是如何演变成高耐菌还有待进一步探讨。近年研究表明，其演变方式是由单位点逐步向多位点突变发展，导致DNA旋转酶、细胞膜通透性发生变化，引起大肠埃希菌对环丙沙星高度耐药［1］。当然并非大肠埃希菌gyrA基因发生突变就一定会引起对环丙沙星产生耐药。Lehn等［2］研究表明包括喹诺酮类耐药大肠埃希菌和ATCC菌株在内，gyrA&127;基因某些位点发生突变（沉默基因），由于其编码的氨基酸序列未发生改变，并不引起大肠埃希菌对环丙沙星产生耐药性。由此可见大肠埃希菌对环丙沙星产生耐药性的机理非常复杂，我们仅对临床菌株gyrA基因突变情况进行了探讨，其意义在于了解临床分离大肠埃希菌gyrA基因突变现状，对控制大肠埃希菌耐环丙沙星有一定帮助。其他与耐药有关的因素如菌株细胞膜通透性改变、大肠埃希菌对药物的主动排泄，以及gyrB基因等在产生耐药性过程中是如何相互发挥作用的，均有待进一步深入探讨。
作者：张军民 吴坚 赵莉萍 程彦国 刘梅 周贵民
单位：100853 北京，解放军总医院微生物科
参考文献
1Acar JF, Goldstein FW. Trends in bacterial resistance to fluoroquinolones. Clin Infect Dis, 1997,24(Suppl 1):67-73.
2 Lehn N, Stower-Hoffmann J, Kott T, et al. Characterization of clinical isolates of Escherichia coli showing high levels of fluoroquinolone resistance. J Clin Microbiol, 1996, 34:597-602.
3 林万明.细菌分子遗传学分类鉴定法.上海：上海科学技术出版社,1990.52-54.
4吴冠芸，方福德.基因诊断技术及应用.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1992.208-209.
5 Pena C, Albareda JM, Pallares R, et al. Relationship between quinolone use and emergence of ciprofloxacin-resistant Escherichia coli in bloodstream infections. Antimicrob Agents Chemother, 1995,39:520-524.
6Yoshida H, Bogaki M, Nakamura M, et al. Quinolone resistance -determining region in the DNA gyrase gyrA gene of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother, 1990, 34：1271-1272.
7 Fisher LM, Lawrence JM, Josty IC, et al. Ciprofloxacin and the fluoroquinolones. New concepts on the mechanism of action and resistance. Am J Med, 1989,87 (Suppl 5A) ：2S-8S.
8 Vila J, Ruiz J, Goni P, et al. Mutation in the gyrA gene of quinolone -resistant clinical isolates of acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother, 1995,39:1201-1203.
