产空泡毒素幽门螺杆菌感染的临床意义

录入时间:2010-12-3 13:22:56 来源：细胞与分子免疫学杂志

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡和萎缩性胃炎的重要病因之一，并与胃癌、胃淋巴瘤的发生密切相关，其中人群中的感染率超过50％，目前已被世界卫生组织列为一级致癌因子^〔1〕。Hp的致癌因子包括：尿素酶、脂多糖、热休克蛋白、磷脂酶和空泡毒素(vacuolatingcytotoxin，VacA)等。其中VacA蛋白仅有部分菌株产生，可引起上皮细胞出现空泡样变及胃粘膜病变。为了解重庆地区HpVacA＋株的感染与不同消化道疾病的关系，我们采用ELISA法和细胞培养法，检测了本校西南医院消化科住院患者HpVacA＋株感染的情况。

　　1　材料和方法

　　1.1材料Hella细胞与Hp标准产毒株为本室保存。包被用VacA为本室基因工程表达产物。MeM细胞培养液为Gibico公司产品。辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(HRP羊抗人IgG)购自华美公司。酶标仪为Beckman公司产品。

　　1.2方法

　　1.2.1Hp菌的分离培养取消化病患者的胃粘膜标本48人份，并同时抽取外周血分离Hp菌。首次分离时，采用牛心、脑浸液固体培养基，于微需氧条件下37℃培养48h，做革兰氏染色观察形态，并做尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶试验鉴定Hp菌。常规分离血清，置20℃冻存待用。

　　1.2.2Hp菌VacA的活性检测①分离Hp菌及VacA的收集，参照文献〔2〕进行。②用MeM细胞培养液(含150mL/L小牛血清和100kU/L青、链霉素双抗)，于37℃70mL/LCO2条件下培养Hella细胞，至计算数达10⁸/L以上。加于96孔细胞培养板中，每孔100μL，并加入100μLVacA，于37℃70mL/LCO2条件下培养18～24h。每份样品做倍比稀释(1∶10，1∶20～1∶160)，每个稀释度测定2次。空白对照孔中加入100μLHp液体培养基上清代替Hp菌培养物的超滤上清。于光镜下计数Hella细胞的空泡样变，细胞空泡形成≥50％者判为阳性。

　　1.2.3外周血清中抗VacA抗体的检测采用ELISA夹心法，操作步骤及结果判定均按照文献〔3〕进行。简要过程是：以基因工程制备的VacA蛋白包被酶标板(100mg/L)，依次用牛血清白蛋白封闭，加入Hp感染患者的血清和HRP羊抗人IgG，用OPD显色后，检测A405nm值。结果判定：测试孔A405nm值－空白孔A405nm值/阴性对照孔A405nm值－空白孔A405nm值≥2.1者判为阳性。另将Hp产毒标准株超声粉碎后，以12000×g40℃离心20min。取上清包被作为阳性对照，以VacA稀释液包被作为阴性对照。

　　2　结果

　　从48例消化病患者胃粘膜及外周血中，共分离出Hp菌42株。分离菌VacA的活性检测表明，约有62％的菌株可产生VacA；用ELISA法检测抗VacA抗体的阳性率为45.8％。不同疾病患者的标本中分离的Hp产毒株的阳性率及不同Hp菌感染患者标本产生VacA的活性，以及血中抗VacA抗体的滴度均不相同，结果见表1。

表1不同疾病患者标本中分离的Hp产毒株

病种	n	分离的	VacA＋株	VacA＋活性抗	VacA抗体
		Hp株	感染率(％)	滴度( ±S)	阳性率(％)
胃溃疡	18	16	61	58±10.52	44.4
十二指肠溃疡	12	10	50	32±8.75	58.3
慢性胃炎	8	6	12.5(1/8)	20	25.0
胃癌	10	10	80	65±16.36	70.0

　　3　讨论　　本研究证实，Hp菌的培养上清可诱导Hella细胞空泡形成，其产毒素株的阳性率为62％，与Leunk等^〔2〕的报道相似。抗VacA抗体的检出，可间接说明不同Hp菌株产生的VacA的活性有差异。消化性溃疡、胃癌患者感染Hp产毒株的阳性率和抗VacA抗体的检出阳性率高于慢性胃炎组(P∨0.01)，提示VacA与较严重的胃粘膜病变有关。

　　VacA是一种相对分子质量(Mr)为87000的蛋白质，由Mr为136000的前体水解而形成。其对胰蛋白酶敏感、不耐热，可引起组织细胞出现空泡和变性环死。Atherton等^〔4〕发现，VacA基因有3种不同的信号区和2个不同的中间区(S1a，S1b，Si，m¹和m²)，其等位基因有5种重组体(sla/m1，sla/m²，slb/m¹，slb/m²和s²/m²)。其中只有s1/m¹产生的VacA活性高；而s²/m²株几乎测不到细胞毒性，说明VacA的表达及活性与其基因亚型有关。临床上发现，约有60％Hp可产生VacA，也是由于VacA基因亚型的不同所致。本实验中，抗VacA抗体的阳性率低于Hp菌的感染率，也说明不同基因亚型产生的VacA活性不同，诱发机体产生免疫应答的程度不同所致。Timothy等^〔5〕对VacA蛋白的N端氨基酸序列分析发现，VacA与大肠杆菌K⁺－Na⁺ATP酶的β链、人K＋－Na＋ATP酶的α亚单位及人胃K⁺－Na⁺ATP酶的α亚单位等离子通道或转运蛋白部分同源。由于胃酸的分泌是由壁细胞H⁺－K⁺ATP酶所介导，因此，VacA可能通过作用于壁细胞中的H⁺－K⁺ATP酶而影响胃酸的分泌，从而使Hp菌逃避胃酸对其损害，定植于胃粘膜上。另外，细胞膜内外K⁺－Na⁺浓度的维持需K⁺－Na⁺ATP酶；而K⁺－Na⁺浓度的变化又可通过影响细胞中细胞器的毒素系统而导致VacA异常分泌，引起上皮细胞空泡样改变。VacA诱导上皮细胞空泡样改变的机制，可能是干扰了细胞膜内外K⁺－Na⁺的正常转运，使膜内外K⁺－Na⁺浓度发生异常变化而导致VacA异常释放。

　　VacA在Hp致病性中的作用，尤其是其与消化性溃疡及胃癌的关系已引起众多学者的重视。早期诊断并消除VacA⁺株感染，可大大降低消化性溃疡和胃癌的发病率。进一步阐明VacA蛋白的结构、功能及其致病机制，对Hp与胃炎、消化性溃疡和胃癌的病因学关系，以及对Hp感染的选择性治疗都将有十分重要的意义。另外，还可研制VacA佐剂疫苗，通过消除Hp感染，治疗消化性溃疡和预防胃癌的发生。

　　作者简介:鲁东水，男，36岁，实验师重庆市高滩岩，Tel.(023)68752315

　　参考文献：

　　〔1〕范学工，夏华向 . 幽门螺杆菌感染 — 基础与临床〔M〕 .长沙：湖南科学技术出版社， 1997： 7－ 37.

　　〔2〕 leunk RD, Johnson PT, David BC, et al. Cytotoxin activity in broth culture filtrates of Campylobacter pylori〔J〕 . J Med Microbiol, 1988; 26: 93.

　　〔3〕 Easton KA, Brooks CL, Morgan DR, et al. Serology detection of antibodies to Helicobacter pylori in children and adolescents using ELISA〔J〕 . Infect Immun, 1991; 59: 2470－ 2475.

　　〔4〕 Tummuru MKR, Cover TL, Blase MJ. Cloning and expression of a high molecular mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production〔J〕 . Infect Immun, 1993; 61: 1799.

　　〔5〕 Cover TL, Tummuru, MKR, Cao P, et al. Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori〔J〕 . J Biol Chem, 1994; 269: 10566.

　　〔6〕 Atherton JC, Ping C, Peek PM, et al. Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains〔J〕 . J Biol Chem, 1996; 270: 17771.

　　〔7〕 Timothy L, Cover TL, Martin JB, et al. Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori〔J〕 . Am J Biol Chem, 1992; 267:10570－ 10575

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