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【摘要】 目的 对临床耐多药志贺菌株H24的1种小多重耐药性家族(SMR)外排泵emrE基因进行定向分子进化，研究基因突变增强emrE外排泵耐药性的潜力，调查志贺菌外排泵基因emrE基因垂直进化对临床耐药发展的影响。 方法 通过用体外易错PCR(EP-PCR)方法对emrE基因进行随机突变实验，用微量稀释生长曲线法进行菌株的耐药性筛选，用荧光实时定量RT-PCR测定基因表达情况，应用DNA分析软件DNAStar进行生物信息学分析。结果 在31个突变子中筛选到了突变子ep2-emrE(DH5α)，它的emrE基因有6个氨基酸突变, 分别为Thr-28→Ala，Cys-39→Ser，Tyr-40→终止子， Ser-72→Arg，Leu-93→Phe，Ile-101→Phe。它不但增强四环素和红霉素的耐药能力，还产生新的氯霉素耐药能力。结论尽管emrE基因较易获得新增耐药性，但在志贺菌对四环素、红霉素等抗生素耐药性发展中，emrE基因的进化突变没有被筛选，表明有其他能力更强的耐药基因在突变进化中起作用。
【关键词】 志贺菌;耐药性;emrE基因;分子进化
Effect of genetically modified efflux pump emrE in isolated Shigella spp. WU Jian, MU Ruirui, REN Cunbang, et al.College of Public Health ,
Abstract： Objective To study the potential gene mutation increasing the drug resistance ability of emrE efflux pump via genetic modification of the emrE gene from clinical isolated Shigella spp. strain H24, and to investigate the relationship between clinical drug resistance development of Shigella spp. and the vertical evolution of emrE efflux pump. Methods Gene emrE was mutated via error prone PCR.Drug resistance of the strain was determined by microdilution growth curve method.The expression of the genes was measured by fluorescent quantitative RTPCR and the bioinformatics analysis was conducted by DNAStar. Results Among the 31 mutants, ep2emrE showed the ability of increasing tetracycline and erythromycin resistance and the newly gained ability of chloromycetin resistance indicating the mutational potent of the gene. Conclusion Although it is easy for gene emrE to achieve new drug resistant ability, the mutation and vertical evolution of the emrE gene is not selected in the development of tetracycline and erythromycin resistance.So,there may be some more strong multidrug resistance genes and mutation.
Key words： Shigella spp.; drug resistance; emrE gene; molecular evolution
细菌的药物外排作用是近10年发现的重要耐药机制，它在细菌中广泛存在〔1〕。一种外排泵可排出结构完全不相干的多种药物，因而可造成耐多药性。对大肠埃希菌基因组的调查显示，至少存在37种外排泵，包括耐单药和耐多药外排泵，分属5个外排泵家族〔2〕。耐多药志贺菌H24的emrE外排泵是一种最简单的外排泵，属于小多重耐药性家族(small multidrug resistance, SMR)，也是一种研究最充分的耐多药外排泵。它可以表达对一价阳离子及亲脂性阳离子如红霉素、磺胺噻唑钠、四环素、磺胺嘧啶钠、溴乙啶和结晶紫的耐药性〔3〕。本研究通过体外随机突变获得突变体，对emrE基因垂直进化进行研究，获得了耐药功能增强和新的耐药功能的突变基因，并探讨了该基因的突变对细菌耐药能力进化的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 (1)菌株：大肠埃希菌DH5α，临床分离志贺菌耐多药株H24(郑州大学公共卫生学院流行病教研室收集保存); (2)载体：pMD18-T 载体(宝生物大连有限公司);(3)工具酶及试剂：SacⅠ内切酶、BamHⅠ内切酶、胰RNA酶、DNA 回收试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM荧光扩增体系(宝生物大连有限公司);抗生素(中国药品生物制品检定所);酵母提取物和蛋白胨(英国Oxiod公司)。营养肉汤水解酪蛋白培养基(MH)(北京奥博星公司)。
1.2 方法
1.3 生物信息学分析 肽链序列比对分析由DNASTAR Inc.的 DNAStar Lasergene软件处理。
2 结 果
2.1 EP-PCR扩增(图1) 经过条件摸索和优化，2次EP-PCR(epA,epB)扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，均在约1100 bp处有一特异扩增条带，分子量大小与预期扩增值相符。将EP-PCR扩增产物与pMD-18T载体连接，并转入DH5ɑ菌株进行筛选，共得到31株重组株。提取质粒酶切电泳检测后，送样测序。
注：M:DL2000 Marker; 1,2：epA-emrE; 3：epB-emrE。
图1 EP-PCR扩增产物凝胶电泳分析
2.2 菌株的耐药性变化(图2) 选用不同EP-PCR变异株 pMD- ep1-emrE(DH5ɑ)和pMD- ep2-emrE(DH5ɑ)，通过微量稀释生长曲线法测定这2株进化菌株及出发基因对照株pMD-emrE(DH5ɑ)和空质粒对照株pMD (DH5α)对利福霉素、红霉素、硫酸新霉素、四环素、氯霉素、环丙沙星和强力霉素的耐药性。从生长曲线可以看出，pMDep2emrE(DH5ɑ)菌株对四环素、红霉素和氯霉素的抗性比含原始基因株pMD-emrE(DH5ɑ)增高，其中氯霉素为新获得的耐药性, 表明经进化突变的ep2-emrE基因外排活性增强。图2 pMD-epl-emrE(DH5ɑ)和pMD-ep2-emrE(DH5ɑ)耐药性变化2.3
重组菌株中EP-PCR emrE基因表达 为近一步确认突变基因的表达情况，对重组菌中emrE 基因的表达进行实时荧光定量反转录分析。在溶解曲线中未检测到引物二聚体和其他非特异性荧光信号。荧光实时定量RT-PCR获得pMD(DH
2.4 ep1-emrE、ep2-emrE的序列分析和氨基酸序列同源性比对 对原始emrE和突变基因ep1-emrE、ep2-emrE的DNA测序结果用DNASTAR
3 讨 论
本研究结果表明，在31个突变子中筛选出的突变子ep2-emrE，不但有增强的四环素和红霉素耐药能力，还有新产生的氯霉素耐药能力, 显示这种外排泵基因具有突变增强耐药性的潜力。根据本研究前期结果〔5〕分析，本研究结果尚不能表明这种外排泵基因在临床志贺菌对四环素、红霉素等的耐药性的发展中起着重要作用。原因为：(1)通过对emrE基因的系统发育分析表明，它有很强的进化规律和保守性，在不同种属中有很强的归属性，与个体耐药性无关;(2)本实验所用志贺菌H24是2002年在江西省铜鼓县分离得到的临床耐药株，其emrE基因与20世纪50年代在北京分离的宋氏志贺菌Ss046基因序列竟然完全一致〔5〕，说明50年来志贺菌红霉素和四环素耐药性的迅速发展与emrE基因突变没有关系。
实验结果表明，在细菌中有一个强大的耐药基因武器库，新的药物环境会进化筛选出新的改进型耐药基因。在志贺菌H24中，可能还有更强的红霉素、四环素耐药基因和耐药突变在起作用。因此，象emrE基因这样耐药能力较弱基因的突变在临床上未被筛选。在志贺菌中起作用的红霉素、四环素耐药基因还待进一步研究。
作者：吴健 穆瑞瑞 任存邦 王春阳 李珏 张卫东 范清堂 段广才
【参考文献】
〔1〕 Piddock LJ.Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistance efflux pumps in bacteria[J].Clinical Microbiology Review,2006,19(2):382-402.
〔2〕 Nishino K,Yamaguchi A.Analysis of a complete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli[J].J Bacteriol,2001,183 (20): 5803-5812.
〔3〕 Sharoni M,SteinerMordoch S,Schuldiner S.Exploring the binding domain of emrE,the smallest multidrug transporter[J].J Biol Chem,2005,280(38):32849-32855.
〔4〕 吴健，张少平，任存邦，等.志贺菌外排泵cmr基因克隆及耐药作用[J].中国公共卫生,2007,23 (12): 1494-1495.
〔5〕 吴健,张少平，穆瑞瑞，等.志贺菌外排泵基因 emrE 的克隆表达及进化分析[J].中国抗生素杂志，2007,32(10): 621-626.
〔6〕 Eggertsson G,Sll D.Transfer ribonucleic acidmediated suppression of termination codons in Escherichia coli[J].Microbiological Reviews,1988,52(3)：354-374.
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