福氏志贺菌对诺氟沙星耐药性及耐药机制的研究

摘要　目的:研究福氏志贺菌对诺氟沙星的耐药性及耐药机制。方法:收集福氏志贺菌30株，进行抗菌药物敏感试验，4株耐药菌，1株敏感菌和福氏志贺菌标准菌51573的gyrA基因的N末端编码区进行PCR扩增并克隆和测序。结果:福氏志贺菌对诺氟沙星的耐药率高达53.3%，gyrA基因的序列分析结果揭示存在3个导致氨基酸改变的基因点突变：丝氨酸-83→亮氨酸，天冬氨酸-87→天冬酰氨，天冬氨酸-87→甘氨酸。结论:福氏志贺菌对诺氟沙星已有较高的耐药性，gyrA基因点突变与福氏志贺菌对诺氟沙星的耐药性有关。

　　　关键词:志贺菌属　诺氟沙星　gyr A基因

　　80年代开始诺氟沙星作为新一代的氟喹诺酮类抗菌药物，对氨苄西林等耐药的多重耐药志贺菌表现出强大的杀菌活力，志贺菌的药物敏感率在95%以上^［1，2］。为了解福氏志贺菌对诺氟沙星的耐药性和耐药机制，我们收集了30株福氏志贺菌进行抗菌药物敏感试验，对其中4株耐药菌、1株敏感菌和福氏志贺菌标准菌51573的gyr A基因的N末端编码区进行了聚合酶链反应(PCR)扩增并克隆和序列分析以检测gyr A基因突变。

　　材料和方法

　　一、菌株的收集

　　30株福氏志贺菌于1996年8月在浙江省余杭市第一医院从临床粪便培养标本中分离所得，均经过常规生化和血清学鉴定。随机对其中4株耐药菌、1株敏感菌和福氏志贺菌标准菌51573进行分子生物学研究，志贺菌属诊断血清购自卫生部兰州生物制品研究所。福氏志贺菌标准菌51573购自中国药品生物制品检定所。

　　二、抗菌药物敏感试验

　　纸片法采用Kirby-Bauer法，最低药物抑菌浓度(MIC)测定采用平皿双倍稀释法。诺氟沙星药敏纸片购自浙江省军区后勤部卫生防疫检验所。诺氟沙星标准品由浙江新昌制药厂提供，批号：920807，效价99%。质控菌为大肠埃希菌ATCC25922。

　　三、PCR扩增gyr A基因N末端区

　　由于志贺菌在遗传学上与大肠埃希菌相近，因此我们根据大肠埃希菌DNA旋转酶(Gyrase)基因序列设计引物^［3］。PCR扩增片段位于gyr A基因24～671位点，PCR扩增产物为648bp。引物Ⅰ：5′-TACACCGGTCAACATTGAGG-3′，引物Ⅱ：5′-TTAATGATTGCCGCCGTCGG-3′。染色体DNA的提取见参考文献［4］。100μl PCR混合液包括：10×PCR缓冲液10μl，25mmol/L MgCl₂ 7μl,20mmol/L dNTP 0.5μl,引物Ⅰ 100ng，引物Ⅱ100ng，Taq酶2.5u，模板DNA 50ng,加dH₂O至100μl。PCR条件：94°C预变性5分钟。94°C 1分钟，56°C 45秒，72°C 30秒，共35个循环。反应结束后72°C延伸10分钟。PCR重复进行2次，PCR所用引物及试剂均购自美国Promega公司。PCR仪为美国Perkin Elmer公司的PE480热循环仪。

　　四、PCR产物克隆

　　使用美国Promega公司的pGEM-T Easy Vector SystemsⅠ进行PCR扩增产物的克隆。连接反应包括：T4 DNA ligase 10×Buffer 1μl,pGEM-T Easy vector 1μl(50ng),PCR 产物 2μl(30ng),T4 DNA Ligase 1μl(3u),dH₂O 5μl,4°C过夜。感受态细胞为大肠埃希菌DH5α。将转化细胞培养液均匀涂布在含有氨苄西林(50μg/ml)的麦康凯平板上，根据α-互补现象，37°C过夜后挑取白色单个菌落于LB液体培养基增菌后用碱法抽提质粒。EcoRI单酶切进行重组子的鉴定，转化试验及其他操作过程参见美国冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》^［5］。

　　五、gyr A基因序列测定和分析

　　按照Sanger双脱氧链末端终止法，使用美国Promega公司的Taq Track Sequencing Core System kit进行测序反应，详细过程参见使用手册，测序反应和电泳重复2次。手动测序仪为美国生命技术公司生产的GiBcoBRL sequencing Model S2 DNA测序仪，放射性同位素采用α-³²P dATP，购自北京亚辉生物医学工程公司。

　　结果

　　一、生化与血清学鉴定

　　共分离志贺菌30株，均为福氏志贺菌，未见其他血清型。

　　二、抗菌药物敏感试验结果

　　30株福氏志贺菌中有16株对诺氟沙星耐药，耐药率达53.3%，对诺氟沙星的MIC范围为0.25～128mg/L,MIC₅₀为32mg/L，MIC₉₀为32mg/L，用于gyr A基因测定的5株福氏志贺菌的MIC依次为32、64、32、32、0.25mg/L。纸片法与MIC的结果相符。

　　三、PCR反应产物的电泳结果

　　见图1。

M：1kb分子量标准，1～4：耐药菌，5：敏感菌，6：福氏志贺菌标准菌51573，C：空白对照图1　0.7%琼脂糖凝胶电泳，EB染色

　　四、gyr A基因序列的聚丙烯酰胺凝胶电泳同位素放射性自显影结果

　　见图2。gyr A基因序列及相关氨基酸的结果见表1。敏感菌和标准菌的gyrA基因序列与国外报道的序列完全相同^［6］，与大肠埃希菌在氨基酸位点85及89上存在碱基变异但不引起氨基酸改变。

　　讨论

　　诺氟沙星作为治疗细菌性痢疾的药物在初期取得了很好的疗效，但随着这类药物使用的增多其耐药性逐渐上升。本研究中我们在流行季节用不到1个月的时间里收集到的30株福氏志贺菌对诺氟沙星的耐药率达到53.3%(16/30)。这数字较国内其它报道的结果相对较高^［7］，可能与我们收集菌株偏少且过于集中有关，有待于扩大样本数量更广泛地进行流行病学的调查。细菌对氟喹诺酮类药物产生耐药机制主要为三方面：(1) Gyrase基因点突变；(2)膜通透性下降；(3)主动流出系统。其中gyr A基因发生点突变是造成细菌产生耐药性的主要原因^［8］。国外对氟喹诺酮类药物耐药机制已有较多的研究，其中对gyr A基因点突变的研究最引人关注，研究已经发现gyr A基因突变的位点集中发生在N末端核苷酸序列为199至318的一个小区间内，此区间已被公认为氟喹诺酮类药物耐药决定区^［9］，并已发现在编码氨基酸67、81、83、87、106等位点上的染色体DNA上出现导致氨基酸改变的碱基点突变。但这些研究大多集中于大肠埃希菌以及金黄色葡萄球菌等，对志贺菌的研究甚少。Horiuchi等^［10］在7株对氟喹诺酮类药物敏感性下降的宋内志贺菌的研究中发现同位素¹⁴C标记的氧氟沙星在这些细菌内的蓄积与敏感菌相同，氧氟沙星对这些细菌DNA的合成抑制作用甚少，并通过体外DNA旋转酶活性的研究推测这些细菌对氟喹诺酮类药物敏感性下降是由于gyr A基因突变造成的。Rahman等^［6］发现痢疾志贺菌Ⅰ型对萘啶酸耐药是由于gyr A基因氨基酸83位点上C→T碱基突变导致丝氨酸突变为亮氨酸造成的。迄今为止，国内外关于福氏志贺菌对氟喹诺酮类药物耐药机制的研究，目前作者尚未见有报道。

　　我们通过对gyr A基因序列的对比研究中首次发现在耐药福氏志贺菌gyr A基因的83、87氨基酸位点上存在着导致氨基酸改变的基因点突变。因此，我们认为这些临床分离的福氏志贺菌对诺氟沙星产生耐药性与gyr A基因的点突变有关，在这些耐药菌中是否存在细菌膜对药物的通透性下降或主动流出系统尚待进一步的研究。

　　作者单位：310003　杭州，浙江医科大学附属第一医院(丁建强、吴仲文、马亦林、龚正、陈亚岗)；浙江省余杭市第一医院(王建华)

　　参考文献

　　1　包幼迪，俞树高，戴赓孙，等.痢疾杆菌耐药性变异的研究.中华微生物和免疫学杂志，1982，2：304-307.

　　2　聂青和，张开瑞，黄上媛，等.细菌性痢疾3018例的菌群分布与药敏试验.人民军医，1995，429：35-37.

　　3　Swanberg SL, WANG JC. Cloning and sequencing of the Escherichia coli gyr A gene coding for the A subunit of DNA gyrase. J Mol Biol, 1987, 197:729-736.

　　4　卢圣栋，主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.415-417.

　　5　金冬雁，黎孟枫，译.分子克隆实验指南.第二版，北京：科学出版社，1992.49-56.

　　6　Rahman. M, Mauff. G, Levy. J, et al. Detection of 4-quinolone resistance mutation in gyr A gene of shigella dysenteriae type 1 by PCR. J Antimicrob Chemother, 1994, 38:2488-2491.

　　7　孙殿兴，李仕英，张福广，等.1986～1995年629株痢疾杆菌菌型分布及药敏调查.中华传染病杂志，1997，15：172-174.

　　8　Lewin. CS, Allen RA, Amyes SGB. Potential mechanisms of resistance to the modern fluorinated 4-quinolones. J Med Microbiol, 1990, 31:153-161.

　　9　Yoshida H, Bogaki M, Nakamura M, et al. Quinolone resistance-determining region in the DNA gyrase gyr A gene of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother, 1990, 34:1271-1272.

　　10　Horiuchi S, Inagaki Y, Yamamoto N, et al. Reduced susceptibilities of shigella sonnei strains isolated from patients with dysentery to fluoroquinolones. J Antimicrob Chemother, 1993, 37: 2486-2489.

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