短小芽孢杆菌作试验菌测定四环素类抗生素效价

摘要　采用管碟法，测定短小芽孢杆菌对四环素类抗生素的敏感度，并与藤黄微球菌进行比较。结果概率分析表明，两种试验菌测定的效价无显著差异，表明短小芽孢杆菌法优于中国药典1995年版方法。
　　四环素类抗生素(土霉素、金霉素、四环素等)微生物检定法采用的试验菌种，各国药典规定不一。英国药典^〔1〕采用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，美国药典^〔2〕采用金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，日本标准^〔3〕与中国药典^〔4〕均采用藤黄微球菌(Micrococcus lutea)。鉴于以藤黄微球菌作试验菌存在诸多缺点(菌种容易变异、培养时间长、抑菌圈边缘欠清晰、测定结果误差大)，而英美两国药典所收载的色谱法^〔1，2〕在我国目前又难于普及，本文试用短小芽孢杆菌作为四环素类抗生素效价测定的试验菌种，并获较满意结果。
　　1　材料
　　1.1　药品　四环素类抗生素(西安药厂、光华药厂及福州抗生素厂等，包括原料药、片剂、软膏)；四环素类抗生素标准品(中国药品生物制品检定所)。
　　1.2　实验菌株　短小芽孢杆菌〔CMCC(B)63202〕(按中国药典1995版二部附录72页方法制成透光率为25%的菌液)；藤黄微球菌〔CMCC(B)28001〕(制成透光率为20%的菌液)。
　　1.3　培养基　Ⅰ号培养基pH 7.8～8.0，Ⅱ号培养基pH 6.6(中国药品生物制品检定所)。
　　1.4　磷酸盐缓冲液　pH6.0缓冲液(KH₂PO₄ 8 g，K₂HPO₄ 2 g，加水至1L；pH8.0缓冲液(KH₂PO₄ 0.523 g，K₂HPO₄ 16.73 g，加水至1L)；pH 4.5缓冲液(KH₂PO₄ 13.6 g，加水至1L)。
　　2　方法
　　采用短小芽孢杆菌：一剂量法^〔5〕测定四环素与土霉素效价的标准曲线剂间比例为1∶0.8，中心浓度为8 u/ml，浓度范围为4～20 u/ml。二剂量法^〔4〕高低剂量分别为8，4 u/ml。一剂量法测定金霉素效价的标准曲线剂间比例为1∶0.8，中心浓度为1 u/ml，浓度范围为0.25～10 u/ml。二剂量法高低剂量分别为1，0.5 u/ml。
　　采用藤黄微球菌：标准曲线制备同中国药典1977年版，二剂量法按中国药典1995年版操作。
　　2　结果
　　2.1　抑菌圈　采用pH6.0磷酸盐缓冲液及Ⅱ号培养基，短小芽孢杆菌的抑菌圈清晰度较好。按2%～3%比例将短小芽孢杆菌液加入培养基作为菌层，35℃～37℃的条件下培养14～16 h，所得到的抑菌圈大小较为合适(表1)。
表1　短小芽孢杆菌测定抑菌圈直径(mm)

样品	菌液加入量(%)	高剂量	低剂量
四环素	2	22	19
土霉素	2	21	18
金霉素	3	20	17

2.2      试验菌测定的标准曲线　见表2。

 表2　两种试验菌标准曲线斜率

样品	短小芽孢杆菌	藤黄微球菌
四环素	1.67	1.41
土霉素	1.13	1.18
金霉素	1.36	1.49

2.3      两种试验菌测定的效价　表3～5。　

表3　两种试验菌测定土霉素效价对比

样品*	序号	短小芽孢菌	藤黄微球菌	差值
片剂(%)	1	72.3	73.9	－1.6
	2	93.6	93.1	0.5
	3	69.2	69.5	－0.3
	4	98.3	100.1	－1.8
	5	82.2	79.7	2.5
	6	95.4	93.1	2.3
	7	81.3	82.6	－1.3
	8	81.9	81.5	0.4
	9	92.0	91.0	1.0
	10	101.9	102.8	－0.9
原料(u/mg)	11	93.8	92.4	1.4
	12	878	878	0
	13	876	874	4
	14	876	875	1
	15	874	873	1
	16	865	875	－10
	17	859	875	－10

　　注：^*序号12～17样品数据由西安光华制药厂提供

表4　两种试验菌测定四环素效价对比

样品*	序号	短小芽孢杆菌	藤黄微球菌	差值
片剂(%)	1	78.5	76.4	2.1
	2	97.1	91.7	5.4
	3	86.2	89.1	－2.9
	4	94.2	95.8	－1.6
	5	81.3	82.6	－1.3
	6	85.2	86.1	0.9
原料(u/mg)	7	999	978	21
	8	986	978	8
	9	986	976	10
	10	976	979	－3
	11	994	989	5
	12	988	979	9
	13	991	988	3
	14	983	979	4
	15	985	979	6
	16	986	980	6
	17	987	981	6
	18	976	970	6
粗制品(u/mg)	19	716	704	－12
	20	682	681	1

　　注：^*序号8～19样品数据由西安制药厂提供

表5　两种试验菌测定金霉素效价对比

样品	序号	短小芽孢杆菌	藤黄微球菌	差值
原料(u/mg)	1	890.0	896.8	－6.0
	2	877.1	893.6	－16.5
	3	881.0	884.0	－3
	4	871.0	868.2	2.8
	5	888.6	873.4	15.2
	6	906.7	916.9	－10.2
软膏(%)	7	103.8	103.8	0

2.4      杂质含量测定　结果见表6。

表6　两种试验菌测定四环素产品杂质含量结果(u/mg)

杂质名称	短小芽孢杆菌	藤黄微球菌	差值
4-差向四环素	394.8	372.0	22.8
脱水差向四环素	5.9	6.0	－0.1
脱水四环素	17.6	7.6	10.0

　　 4　讨论与小结　　①表2显示，两种试验菌测定结果无显著差异，曲线斜率均较稳定，两条直线互相平行。②表3～表5列出四环素(20批)、土霉素(17批)及金霉素(7批)的考核数据。概率分析表明，两种试验菌测定的效价无显著差异(P＞0.05)。③四环素类抗生素不够稳定，尤其是四环素与金霉素的差向化均较快，产品中差向金霉素含量可高达16%～17%。表6显示，两种试验菌对各种杂质的敏感度无明显差异(表中脱水四环素之测定含量两项数据，有待进一步予以验证)。④四环类抗生素微生物检定法改用短小芽孢杆菌测定的优点在于：菌液稳定，可保存较长时间，供随时取用，无需临时制备；菌种灵敏；抑菌圈成形快(培养时间短于15 h)；抑菌圈清晰，边缘整齐，便于准确测量，故而误差小，复试率低；菌液耐温，可在70℃左右的培养基上摊布菌层。

作者：傅燕芳  张正洁  张玉良  李晓珍

作者单位：西安市药品检验所!西安710054 西安制药厂 西安制药厂 西安市药品检验所!西安710054
　　参考文献
　　1　BP 1993：150，472，661；A166
　　2　USP ⅩⅩⅢ,1995:1510,621(1221)
　　3　日本抗生物质医药品基准解说1990：333
　　4　中国药典1995年版二部.1995：附录70～74
　　5　中国药典1977年版二部.1997：附录

 

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