黄连素、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠对痢疾杆菌耐药质粒的消除作用

 摘要　比较了黄连素二硫酸盐(BDH)、溴化乙锭(EB)、十二烷基硫酸钠(SDS)不同浓度、不同处理时间和方式对痢疾杆菌耐药质粒的消除作用。结果表明：BDH对痢疾杆菌耐药质粒的消除作用较小；EB对痢疾杆菌的耐药质粒有较好的消除作用，以连续培育法处理120h，消除率可达85%；SDS对痢疾杆菌的耐药质粒有一定的消除作用，以高温高浓度双重处理交替培养，消除率可达27%。
　　细菌的耐药性是治疗细菌性疾病一个难题。我们在研究痢疾杆菌的耐药性基因定位过程中，发现黄连素、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠对痢疾杆菌耐药质粒均有不同程度的消除作用。现报告如下。
　　1　材料
　　1.1　菌株　20株多重耐药性痢疾杆菌，每株菌转代10管 ，共200管菌做质粒消除试验。菌株来源及鉴定见文献^〔1〕。
　　1.2　试剂　黄连素二硫酸盐(BDH)、溴化乙锭(EB)、十二 烷基硫酸钠(SDS)(均为进口分装，购自华美公司)。
　　2　方法和结果
　　2.1　质粒消除试验　采用连续培育法和高温高浓度双重 处理交替培养法。前者以Bouanchard法^〔3〕为基础：将菌株接种于LB肉汤中，37℃ 振荡培养6h。调整浓度至10^－5左右，取0.1ml接种于含一定浓度消除剂的LB肉汤 中，继续振荡培养。细菌呈轻微浑浊生长时，取出菌液稀释至10^－5；取0.1ml转种 于含同样浓度消除剂的肉汤中，继续振荡培养6h。重复上述步骤，在选定的时间内(如24，4 8，120h)，少量快速提取质粒DNA，电泳检查质粒消除情况。后一种方法是：将菌株接种于含一定浓度消除剂的LB肉汤中，41℃振荡培养16h。取20μl菌液，接种于2ml LB肉汤管中， 41℃振荡培养16h后；再取20μl菌液接种于含同样浓度消除剂的LB肉汤管中，41℃培养16h ；取出50μl菌液接种于5ml LB肉汤管中，37℃培养16h。以碱裂解法快速提取质粒DNA，检 测质粒消除情况。质粒未消除的，重复上述处理步骤(一个处理周期64h，两个周期128h)。比较不同浓度、不同处理方式和时间BDH、EB、SDS对质粒的消除作用，筛选最佳的消除浓度 和方法。
　　2.2　质粒消除的检测　以碱裂解法^〔2〕小量提 取质粒DNA，1%琼脂糖电泳，EB染色，紫外投射仪检测质粒消除情况。
　　2.3　结果　若以BDH、EB为消除剂，则连续培育法效果较 好，二者的处理浓度分别为100μg/ml和30μg/ml。若以SDS为消除剂，则以高温、高浓度双 重处理交替培养法效果较好，处理浓度为60μg/ml。三种试剂相比，EB对质粒的消除作用最 好，SDS次之，BDH最弱(见表1)。
　　　　表1　三种试剂对痢疾杆菌耐药质粒的消除率(%)

　　*P＜0.01

3　讨论
　　研究结果表明：EB对痢疾杆菌质粒的消除作用最好；以连续培育法，48h消除率可达20%，12 0h可达85%，随着处理时间的延长消除率明显提高。Rubin^〔4〕等报道，延长时间未能提高质粒的消除率。我们推测，这可能与他们的试验方法有关。若细菌只在含消除剂的肉汤里转种一次，在细菌数目不断增多、而消除剂浓度保持不变的情况下，每个细菌平均所受消除剂的作用实际在下降；加之代谢产物不断积累，营养成分不断减少，即使延长时间，也难以提高消除率。Smith等^〔5〕报道若第一次消除试验不能成功，可将试验菌株在含有消除剂的肉汤里转种几次。据此我们对Bouanchard法做了改进，使菌株在试验过程中处于相对恒定的消除剂作用之下，并保证培养基中营养的丰富和pH值相对稳定，产生了较好的消除作用。试验结果表明，黄连素对痢疾杆菌的耐药质粒也有消除作用，但消除率较低，用连续培育法处理120h，消除率只能达到8%。消除率未能随着处理时间延长而提高。我们还摸索出高温(41℃)、高浓度(60μg/ml，相当于0.006%)SDS双重处理交替培养法，即先找出能容许细菌生长的SDS的最高培养浓度，在这个高浓度下高温处理。在含高浓度SDS的LB肉汤中交替传代，经反复验证，效果良好，消除率可达27%。

作者：杨春梅; 马治平; 王志鹏; 杨俭;

作者单位：兰州军区卫生防疫大队

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