致泻性大肠杆菌中发现小肠结肠炎耶尔森菌毒力岛

【 摘要 】　目的　研究肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌(ESIEC)菌株是否含有耶尔森菌的HPI(毒力岛)基因。 方法　采用PCR扩增和Southern杂交的方法。结果　从35%的ESIEC菌的染色体上同时扩出irp1、irp2和fyuA 3个片段，片段大小分别与小肠结肠炎耶尔森菌WA菌株的相应片段一致，鼠疫耶尔森菌HPI上的6对引物均未扩出目的片段。65%的ESIEC使用以上9对引物未扩出目的片段。ESIEC菌的染色体EcoRI酶切产物电泳后与小肠结肠炎耶尔森菌WA菌株的fyuA探针杂交出大小一致的条带，与irp1和irp2探针杂交出不同的带型。 结论　ESIEC菌含有小肠结肠炎耶尔森菌的HPI，且有变异现象。ESIEC和EAEC的关系还有待于进一步的研究。

　　【 Abstract 】　Objective　To study whether the genes of HPI island of Yersinia is existed in enteric Shigelloid-toxin producing and invasive Escherichia coli (ESIEC). Methods　PCR amplification and Southern blots. Results　The PCR results showed that 35% ESIEC strains (n=43) yielded irp1, irp2 and fyuA fragments, of which the molecular size were identical to those of Yersinia enterocolitica WA. All of the E.coli strains tested were negative for other genes of HPI island which were existed in Y. pestis but not in Y.enterocolitica. The two E.coli strains with irp1, irp2 and fyuA gene were selected for further study. The chromosomal DNA was digested by EcoR Ⅰand hybridized with irp1, irp2 and fyuA DNA probes respectively, which were synthesized by PCR with chromosomal DNA of Y. enterocolitica as template. When fyuA probe was used, the Southern hybridization patterns of the two E. coli strains were identical to that of Y. enterocolitica WA. When irp1 and irp2 probe were used, the molecular size of hybridized fragments were different from that of Y. enterocolitica WA. Conclusion　The HPI island of Y. enterocolitica was found to exist in 35% of ESIEC strains tested, and variation in restriction sites of various genes was observed.

　　【 Subject words 】　Diarrheagenic Escherichia coli; Yersinia spp; Pathogenicity island

　　根据毒力因子、致病机理、临床特征等研究进展，目前国际上把致泻性大肠杆菌分为五类：产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli, ETEC )、致病性大肠杆菌（enteropathogenic E.coli, EPEC）、出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli, EHEC)、集聚性粘附大肠杆菌(Enteroaggregative E.coli, EAggEC)和侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive, E.coli, EIEC)^〔1〕。徐建国等人从我国分离并命名了一类新的致泻性大肠杆菌，即产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌（Entero-shiga-like-toxin-producing and invasive E.coli, ESIEC）。这类菌能同时与Inv、SLT1或SLT2探针杂交呈阳性反应，对Hep-2细胞呈集聚性粘附，但不与EAggEC特异性探针反应，且不具有EIEC及志贺氏菌的ipaB基因^〔2〕。

　　近年来，在医学细菌学领域出现了一个新名词——毒力岛（pathogenicity island）。毒力岛的发现和研究对了解细菌致病性和毒力因子具有重要的意义。许多病原性细菌中都存在着毒力岛，毒力岛和新的病原菌的产生有着密切的关系^〔3,4〕。目前已在泌尿道致病性大肠杆菌、沙门菌、志贺杆菌、耶尔森菌、幽门螺杆菌、霍乱弧菌等细菌中发现毒力岛的存在^〔3-5〕。耶尔森菌中的毒力岛称之为HPI(High-pathogenicity island)^〔6〕，它是对小鼠致病性所必需的^〔7〕。Schubert等^〔6〕1998年报道在许多粘附性大肠杆菌存在小肠结肠炎耶尔森菌的HPI基因，在一部分ETEC、EIEC、EPEC、EHEC中也存在着HPI。鉴于我们命名的ESIEC菌株具有明显的粘附特性，本研究的目的就是研究ESIEC菌株中是否含有HPI基因。

表1　本研究工作中所用的引物

　　Table 1. Primers used in this work

　　材料与方法

　　菌株：小肠结肠炎耶尔森菌WA株（O8型）由卫生部医学分子细菌学重点实验室景怀奇副研究员提供。43株ESIEC为1988～1990年从北京地区腹泻病患者粪便标本中分离，使用DNA探针进行了检测，被命名为ESIEC的菌株^〔2〕。

　　染色体的制备：提取染色体按Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega公司生产)方法。

　　PCR扩增：以细菌的染色体DNA为模板。所用引物由Sangon公司合成，Taq酶为Sangon公司产品。引物序列见表1。irp1、irp2和fyuA基因为鼠疫耶尔森菌和小肠结肠炎耶尔森菌的共有基因。其余的基因为鼠疫耶尔森菌所特有。

　　Southern杂交：细菌染色体DNA用EcoRI酶切，0.7%琼脂糖凝胶电泳后转印到硝酸纤维素膜上^〔8〕。以小肠结肠炎耶尔森菌染色体DNA为模板，用y7/y8、1-1/1-2和2-上/2-下引物对分别扩增出irp1、irp2和fyuA片段，用DIG DNA Labeling and Detection Kit(Boehring Mannheim,Germany)对这些片段进行标记，分别得到探针irp1、irp2和fyuA。将这些探针在沸水中热变性后分别与硝酸纤维素膜进行杂交。68℃预杂交2h，杂交16h。显色检测按上述Kit说明书进行。

　　结果

　　1.PCR扩增：以各个菌株的染色体DNA为模板进行PCR扩增，43株ESIEC中的15株（35%）能够同时扩出irp1、irp2和fyuA片段，其相对分子质量(M_r)与小肠结肠炎耶尔森菌的相应PCR片段一致（图1）。根据鼠疫耶尔森菌HPI所特有的、小肠结肠炎耶尔森菌所没有的另外的6个基因所设计的引物进行PCR实验，均未在ESIEC菌株中扩增出目的片段。

　　2.Southern印迹杂交：将2株PCR实验证明含有HPI基因的ESIEC菌株和一株PCR实验证明没有HPI基因的ESIEC菌株，提取染色体DNA，用EcoRⅠ酶切，分别用irp1、irp2和fyuA基因的DNA探针进行Southern杂交。结果显示，HPI阳性的ESIEC菌株有1条带与irp1探针杂交，而小肠结肠炎耶尔森菌O8 WA菌株有2条带杂交（图2A）。但是，小肠结肠炎耶尔森菌WA菌株的两条杂交带的M_r之和与ESIEC的杂交条带的M_r一致。因此，可推测小肠结肠炎耶尔森菌O8 WA菌株的含有irp1基因的DNA片段比ESIEC的多出一个EcoRⅠ位点(图3)。

　　小肠结肠炎耶尔森菌O8 WA菌株与irp2探针的杂交条带的分子量比ESIEC菌的杂交条带略小（图2B）。可能是由于WA菌株染色体含有irp2基因的DNA片段的近端存在EcoRⅠ位点，或者是由于EcoRⅠ切点在irp2探针对应ESIEC染色体位置的远端(图3)。

 　　讨论

　　Schubert等^〔6〕1998年报道，在92%的粘附性大肠杆菌、20%的EIEC、5%的EPEC和ETEC、82%的从血液标本分离的大肠杆菌中发现小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因的存在。鉴于HPI在致泻性大肠杆菌中的广泛存在，本研究的目的就是要了解HPI在ESIEC菌株中存在的情况。使用PCR实验发现，35%的ESIEC菌株含有小肠结肠炎耶尔森菌的irp1、irp2和fyuA基因（图1）。进而对2株PCR实验证明含有HPI的菌株和1株不含HPI的ESIEC菌株进行了Southern杂交分析。结果显示，ESIEC中的irp1和irp2基因与小肠结肠炎耶尔森菌略有不同（图2A，2B）。ESIEC菌株和irp1探针杂交的片段比小肠结肠炎耶尔森菌多出一个EcoRⅠ位点。fyuA基因在ESIEC中相对比较保守，杂交带型与小肠结肠炎耶尔森菌一致（图2C）。研究表明，在ESIEC菌株中存在着HPI，并且部分毒力岛基因在酶切位点不同，有变异现象。结果提示，ESIEC菌株的HPI可能和耶尔森菌毒力岛不完全相同，值得进一步深入的研究。

　　我们已经使用DNA探针等技术证明ESIEC和ETEC、EPEC、EHEC、EIEC、EAggEC不同。既然ESIEC和粘附性大肠杆菌都含有HPI，那么二者之间的关系如何粘附性大肠杆菌是很早就命名的一类致泻性大肠杆菌，ESIEC是新近才命名的，是从我国腹泻病患者的粪便标本分离、使用常规方法不能够鉴定的、和志贺样毒素探针杂交的一类大肠杆菌。粘附性大肠杆菌的概念并不明确，除了对上皮细胞的粘附外，到目前为止还没有特异性的鉴定指标。Schubert等使用的粘附性大肠杆菌菌株经细胞粘附实验证明对上皮细胞具有集聚性粘附现象，但是没有进行DNA探针实验， 不清楚是否属于EAggEC。我们的ESIEC对Hep-2细胞也呈集聚性粘附，但不与EAggEC特异性探针反应，不属于EAggEC。动物实验结果提示，ESIEC和EHEC的致病特点相似^〔13,14〕。细胞凋亡实验结果显示，ESIEC和ETEC、EIEC、EPEC、EHEC、EAggEC明显不同，是一类独特的致泻性大肠杆菌^〔15〕。关于ESIEC菌株中的HPI致病作用以及携带HPI的ESIEC菌株和EAggEC的关系，还有待于进一步的研究。

　　HPI毒力岛和LEE毒力岛的发现，给致泻性大肠杆菌的分类和研究带来了一线生机。致泻性大肠杆菌的分类比较复杂，存在着许多的问题。譬如，EPEC、EHEC都含有LEE毒力岛。粘附性大肠杆菌含有HPI毒力岛。随着毒力岛研究的不断深入，很可能致泻性大肠杆菌的分类会发生重大的变化。

　作者：伍建宏 叶长芸 徐建国

　基金项目：国家自然科学基金杰出青年基金资助项目

参考文献

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