大肠杆菌核心型血清学检测方法的建立

【 摘要 】　目的　制备大肠杆菌（E.coli）核心型单一特异性抗血清，建立E.coli核心型血清学检测法，检测致泻性E.coli核心型。方法　ELISA间接法，用吸收后单一核心型特异性抗血清检测鉴定E.coli核心型。结果　(1) 吸收后获得单一核心型特异性抗血清，对E.coli核心型的检测结果与相应单克隆抗体检测结果完全相同；(2) 经鉴定表明，吸收后单一核心型特异性抗血清识别结合的抗原成分既非E.coli核酸和蛋白，又非E.coli类脂A和内核心KDO-庚糖，而是构成E.coli核心型的外核心己糖物质；(3) 四类27株不同血清型致泻性E.coli核心型检测结果为：R1核心型15株(55.5%)、R3核心型10株(37.1%)，K12核心型2株(7.4%)，未检测出R2和R4核心型。结论　吸收后E.coli核心型抗血清具有较高单一核心型特异性，可用于E.coli核心型的检测。

　　【 Abstract 】　Objective　To prepare the core type monospecific antisera of Escherichia coli (E.coli). To establish serological detecting method for core types of E.coli. To detect the distribution of lipopolysacchride core types in pathogenic E.coli.Methods　ELISA indirect method, we detected lipopolysacchride core types of E.coli using absorbed lipopolysacchride core type monospecific antisera in E.coli.Results　(1) The respective core type antisera were made as a monospecific one by repeated absorption. Lipopolysacchride core types of E.coli by absorbed lipopolysacchride core type monospecific antisera is same as that by the monoclone antibody; (2) The results proved that the components being recognized and bound by absorbed core type monospecific antisera was neither nuclei acid and protein nor lipopolysaccharide lipid A and inner-core KDO-heptopyranose, an but outer core hexose antigen composing E.coli lipopolysaccharide core types; (3) Lipopolysaccharide core types of 27 strains of different serotype pathogenic E.coli from 4 classes had been detected. The results showed: 15 strains (55.5%) expressed R1 core type, and 10 (37.1%) and 2 (7.4%) strains expressed R3 and K12 core types respectively. None of the 27 strains of E.coli expressed R2 and R4 core type.Conclusion　The respective core type antisera were made higher monospecific by repeated absorption, and it can be used in detecting E.coli lipopolysaccharide core types.

　　【 Subject words 】　Pathogenic Escherichia coli; Core type specific antisera

　　细菌脂多糖是革兰阴性菌致病的主要物质，通常由暴露于菌体表面的O特异性多糖和与之相连的核心多糖及类脂A三部分组成。O特异性多糖由重复寡糖单位构成，是决定细菌种和血清型的物质基础。核心多糖分为内核心和外核心两部分,前者与类脂A相连，其组成与构型相对恒定，是E.coli所共有的成分，简称KDO-庚糖区^〔1〕，后者与O特异性多糖相连，其单糖组成与构型有所差异，是决定E.coli核心型的物质基础，又称己糖区^〔2〕。用化学分析方法检测发现，在E.coli脂多糖外核心中存在5种不同的寡糖分子结构^〔3〕，分别组成R1、R2、R3、R4和K12核心型，每株E.coli只含其中一种。动物试验表明，核心型特异性抗血清对同核心型E.coli感染具有良好的免疫保护和治疗作用^〔4〕。Ziegler等人^〔5〕用这种核心型特异性抗血清治疗E.coli感染性休克病人已初步获得成功。但在抗血清使用前，必须对临床分离的E.coli进行核心型的检测和鉴定。E.coli核心型特异性单克隆抗体对相应核心型具有高度特异性，可用于E.coli核心型的检测^〔6〕，但由于单克隆抗体制备复杂，难以推广使用。为此我们建立了E.coli核心型血清学检测法，并用该法对四类27株不同血清型致泻性E.coli的核心型进行了检测。

　　材料和方法

　　实验动物：雄性家兔，体重2kg，由首都医科大学动物室提供。

　　菌株：(1) 粗糙型(R) E.coli突变株：F470(R1)、F576(R2)、F653(R3)、F2513(R4)、W3100(K12)和临床分离的经E.coli核心型单克隆抗体鉴定的光滑型(S) E.coli-106(R1)、E.coli-606(R2)、E.coli-922(R3)、E.coli-500(R4)、E.coli-1067(K12)，获自BJ.Appelmelk博士(Free University, Netherland)。(2) 27株不同血清型致泻性E.coli标准株，购自中国医学细菌保藏管理中心。

　　单克隆抗体、抗血清和酶标抗体：(1) E.coli核心型单克隆抗体和E.coli内核心KDO单克隆抗体，获自BJ.Appelmelk博士。(2) 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自军事医学科学院。

　　酶类和其它试剂：(1) 蛋白酶K、DNA酶、RNA酶和高碘酸购自华美生物工程公司。(2) 重组杀菌/渗透增强蛋白(recombinant bactericidal permeability increasing protein，rBPI₂₃)，获自BJ.Appelmelk博士。

　　免疫原、吸收菌和包被抗原的制备：分别取粗糙型(R) E.coli突变株（核心型分别为R1～R4和K12），光滑型(S) E.coli（核心型分别为R1～R4和K12），27株不同血清型致泻性E.coli的肉汤培养物，离心(4?000r/min，20?min)洗涤后，配制细菌悬液10¹⁰CFU/ml。从5种R型E.coli突变株菌液中各取20ml，100℃加热30?min后-20℃保存，用作免疫原和对抗血清进行免疫吸收的抗原。从上述制备的R型、S型、致泻性E.coli菌液中各取20ml，置高压灭菌器内121℃加热30?min后-20℃保存，作为ELISA试验中的包被抗原。

　　核酸酶、蛋白酶K和高碘酸对包被抗原制剂的处理：(1) 取0.5ml包被抗原制剂(2.5×10⁹CFU/ml)与10μg(10μl)DNA酶和5μg(10μl)RNA酶混匀，37℃水浴30?min后加入250μg(50μl)蛋白酶K混匀，37℃水浴90?min，100℃加热10?min将酶灭活，4℃保存。(2) 取0.5ml包被抗原(2.5×10⁹ CFU/ml)加入2.5mmol/L高碘酸(50μl)混匀，室温转鼓作用2?h，加4滴甘油混匀，室温作用30?min后，4℃保存。

　　单一核心型特异性抗血清的制备：用粗糙型E.coli制备免疫原免疫家兔获得相应E.coli核心型抗血清。每种核心型抗血清经其它不同核心型E.coli抗原反复吸收后^〔7〕，获得单一核心型特异性抗血清。分别用粗糙型E.coli突变株抗原和光滑型E.coli抗原包被聚苯乙烯板，然后按ELISA间接法分别加吸收前、后核心型抗血清进行检测，并用核心型单克隆抗体进行核实验证。

　　酶联免疫吸附试验（ELISA）：E.coli核心型检测采用ELISA间接法，在96孔聚苯乙烯板上进行。包被抗原的浓度为10⁹CFU/ml，单克隆抗体浓度为1mg/L；吸收后抗血清稀释度为1∶100，酶标记抗体稀释度为1∶100。曾用单抗证实P/N比值＞2均为阳性，故实验中规定P/N比值＞2为阳性，在表中阳性用“+”表示，阴性用“-”表示。

　　核心型特异性抗血清对E.coli核心型抗原识别的鉴定：(1) S型E.coli-106(R1)经DNA/RNA酶、蛋白酶K和高碘酸分别处理后进行测试^〔8〕，比较处理前后的检测结果。(2) 用E.coli内核心KDO单克隆抗体和rBPI₂₃封闭S型E.coli-106(R1)脂多糖内核心KDO-庚糖和类脂A后进行测试^〔8〕，比较封闭前后的检测结果。

　　结果

　　1.抗血清吸收前后与E.coli核心型抗原特异性结合的检测结果：吸收前抗血清与R型和S型E.coli抗原有广泛的交叉反应。吸收后交叉反应显著降低，每种抗血清与相应E.coli核心型抗原反应的吸光度（A）值，至少比此种抗血清与其它几种E.coli核心型抗原反应的A值大3倍。用相应核心型特异性单克隆抗体核实验证，其核心型检测结果与吸收后抗血清的检测结果相符，表明吸收后抗血清具有单一核心型特异性抗血清，可用于E.coli核心型的检测。见表1。

　　2.吸收后核心型特异性抗血清对E.coli核心型抗原识别鉴定的结果

　　（1）用DNA/RNA酶和蛋白酶K处理S型E.coli-106(R1)抗原破坏核酸、蛋白后，按已建立的ELISA方法测试，结果如图1所示。处理前后S型E.coli抗原与吸收后核心型特异性抗血清反应的A值大致相同。表明吸收后核心型特异性抗血清识别结合的抗原成分不是核酸和蛋白。

　　（2）用高碘酸处理S型E.coli-106(R1)抗原破坏多糖成分后，按已建立的ELISA方法测试，结果显示高碘酸处理后E.coli抗原与相应吸收后核心型特异性抗血清的反应性极大降低，其A值与其它几种核心型特异性抗血清与该抗原反应的A值相似，表明吸收后核心型特异性抗血清识别结合的成分为脂多糖中的多糖物质。

表1　抗血清吸收前后与粗糙型(R)和光滑型(S)大肠杆菌抗原的反应

　　　（3）用E.coli内核心KDO单克隆抗体和rBPI₂₃封闭S型E.coli-106(R1)脂多糖内核心KDO-庚糖和类脂A后，按已建立的ELISA方法测试，结果显示吸收后核心型特异性抗血清与封闭前后E.coli抗原反应的A值大致相同，表明核心型特异性抗血清识别结合的抗原成分既非脂多糖内核心KDO-庚糖、又非类脂A。

　　3.致泻性E.coli核心型抗原的测定结果：8株不同血清型肠产毒性E.coli核心型均为R1核心型；7株不同血清型肠侵袭性E.coli核心型分布为R1核心型4株、R3核心型2株、K12核心型1株；11株不同血清型肠致病性E.coli核心型分布为R1核心型2株、R3核心型8株、K12核心型1株；1株肠出血性E.coli核心型为R1核心型。

　　讨论

　　E.coli核心型检测对指导核心型特异性抗血清的临床应用和对细菌核心型与细菌毒力、药物敏感性及临床致病特点之间关系的研究具有重要意义。为此，我们建立了E.coli核心型血清学检测法。

　　首先用粗糙型(R)E.coli突变株抗原免疫家兔获得相应核心型抗血清。每种E.coli核心型抗血清经其它几种核心型吸收菌反复吸收后，获得单一核心型抗原特异性(表1)。为证实吸收后核心型特异性抗血清识别结合的E.coli抗原确为脂多糖外核心己糖物质，我们用吸收后核心型特异性抗血清对核酸酶、蛋白酶K和高碘酸处理前后的S型E.coli抗原进行了检测。结果表明，吸收后核心型特异性抗血清识别结合的成分不是核酸和蛋白质抗原，确为多糖物质。用rBPI和E.coli内核心KDO单克隆抗体所作的封闭试验证实，吸收后特异性抗血清识别结合的抗原既非脂多糖类脂A，又非内核心KDO-庚糖。上述实验结果可以确定，吸收后核心型特异性抗血清识别结合的成分应是构成E.coli核心型的外核心己糖抗原。

　　用吸收后核心型特异性抗血清建立的ELISA法对四类27株不同血清型致泻性E.coli的核心型进行了检测。在四类27株不同血清型致泻性E.coli中R1核心型15株(55.5%)、R3核心型10株(37.1%)、K12核心型2株(7.4%)，未检出R2和R4核心型，这种检测结果与BJ.Appelmelk等报道^〔8〕的菌血症患者血液中分离的E.coli核心型的检测结果(R1核心型68%、R2核心型6.5%、R3核心型8.7%、R4核心型5.1%、K12核心型2.2%)存在明显差异。这种差异在E.coli核心型与其致病性之间可能存在某种相关关系，有待深入研究阐明。

作者：柯岩　周燕竹　沈海中　黄恕　陈海伦　安云庆

作者单位：柯岩 沈海中 陈海伦安云庆(首都医科大学微生物学和免疫学教研室)；周燕竹(北京同仁医院)；黄恕(北京针灸骨伤学院微生物学教研室)

　　参考文献

　　1，Luderitz O. Current topics in membrances transport. Academic Press, New York. 1982, P17-29.

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　　3，Rietschel ET. Molecular structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity. Endotoxin research series. Vol.1, Amsterdam: Excepta Medica, 1990, P15-23.

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　　5，Ziegler H. Treatment of Gram-negative bacteremia and shock with human antiserum to a mutant Escherichia coli. N Engl J Med, 1982, 302:1225-1230.

　　6，Gibb AP. Frequencies of lipopolysaccharide core types among clinical isolates of Escherichia coli defined with monoclonal antibodies. J Infect Dis, 1992, 166:1051-1057.

　　7，Baumgartner JD, O'Brien TX, Kirkland TN. Demonstration of cross-reaction antibodies to smooth Gram-negative bacteria in antiserum to Escherichia coli J5. J Infect Dis, 1987, 156:136-143.

　　8，Appelmelk BJ, An YQ. Frequencies of lipopolysaccharide core types in Escherichia coli strains from bacteremic patients. Microbiology, 1994, 140:1119-1124.

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