人群脑膜炎奈瑟菌带菌检验方法的研究

【摘要】  目的：研制一种能够在低温下保持脑膜炎奈瑟菌活性并具有增菌作用的培养基。方法：配制一种小牛血清“双抗”培养基，用已知量A、C群脑膜炎奈瑟菌检定其保菌和增菌效果，并用该法在正常人群中检测带菌率，以常规方法的检测结果作配对比较。结果：应用小牛血清“双抗”培养基可使脑膜炎奈瑟菌在4 ℃ 24小时内基本不死亡，部分菌株可生存8天，同时可使存活的细菌从3~9 CFU/ml增加到(6~7)×107 CFU/ml；对364名正常人检测，其检出率达1.65%,而常规方法检出率为0(P<0.05)。结论：小牛血清“双抗”培养基在4 ℃的不利条件下，有显著保菌作用，同时具有显著增菌作用。

【关键词】  脑膜炎奈瑟菌；检验方法；小牛血清；保菌；增菌

    [Abstract]   Objective：  To manufacture one culture medium (for short: new medium) which could keep the life of Neisseria(N.) meningitidis in low temperature, and could augment the number of N.meningitidis.  Methods: One culture medium containing new bovine serum and two kinds of antibiotic was prepared. The effects of  keeping life of  N.meningitidis were detected by  known number of A and C types of N.meningitidis. Then carriers of N.meningitidis in the crowd were detected, compared with the routine detecting method as control.  Results: The new medium could almost keep the life of N.meningitidis for 24 hours in 4 ℃ , and could augment the number of N.meningitidis from 3~9 CFU/ml to （6~7）×107 CFU/ml in 37 ℃. Some strains of M.meningitidis could live for 8 days in the new medium in 4 ℃. With 364 healthy persons detected with the new medium, the positive rate of carrying N.meningitidis was 1.65%, but with routine detecting method, the positive rate was 0 (P﹤0.05).  Conclusion:  In nfavourable condition of 4 ℃, the new medium could keep the life of N.meningitidis distinguishingly. And in the favourable condition of  37 ℃, the new medium had the function of augmenting the number of N.meningitidis prominently.

    [Key words]      Neisseria meningitidis; Detect method; New bovine serum; Keep the life of bacteria; Augment the number of bacteria

    脑膜炎奈瑟菌对干燥、寒冷、热、阳光等非常敏感，在室温中3小时就死亡[1]，同时营养要求也很高。因而对脑膜炎患者或带菌者的检查，常规的检验方法需要用37 ℃预温的巧克力色血琼脂平板进行床边接种，并保温运送至实验室检验，这种方法对人群带菌状况和流行病学的监测尤其困难。为方便监测并反映人群的真正带菌状况，就如何保持脑膜炎奈瑟菌的活性、提高检出率，我们对所用培养基进行了研究。

    1   材料与方法

    1.1   小牛血清琼脂   将市售血琼脂基础培养基配制后121 ℃15分钟灭菌，待冷却至50 ℃左右时，按10%加入小牛血清，作脑膜炎奈瑟菌活菌计数时倾注平板用。葡萄糖蛋白胨水: 含1 %葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%氯化钠，121 ℃15分钟灭菌后备用。小牛血清“双抗”培养基[1]：取上述制备的葡萄糖蛋白胨水溶液198 ml、“双抗”水溶液2 ml（万古霉素、多黏菌素B的浓度分别为660 U/ml和5000 U/ml）、无菌小牛血清200 ml，充分混匀后，用无菌的10 ml吸管分装于无菌的试管中，每管1 ml。血琼脂平板：将市售血琼脂基础培养基加水后121 ℃15分钟灭菌，待冷却至50 ℃左右时，按10%加入新鲜的预温至37 ℃的绵羊血，随加随混匀，再加入万古霉素和多黏菌素B溶液，使其含量分别达到3.3 U、250 U/ml，混匀后倾注平板。巧克力色血琼脂平板：制法基本同前，只是在温度降至80 ℃左右时加入绵羊血，继续冷却至50 ℃左右加入抗生素。A和C群脑膜炎奈瑟菌标准  菌种、脱脂牛奶（加万古霉素和多黏菌素B）、灭菌生理盐水。脑膜炎奈瑟菌标准诊断血清和生物梅里埃胶乳凝集试剂：由国家疾病预防控制中心提供，有效期内使用。

    1.2   A和C群脑膜炎奈瑟菌悬液的制备   将A和C群脑膜炎奈瑟菌标准菌种接种于血琼脂平板，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养18~24小时，括取菌苔，分别用生理盐水、脱脂牛奶、小牛血清“双抗”培养基制成悬液,使含量大约为102~106 CFU/ml。分类分装于无菌试管中，每管6~8 ml。

    1.3   悬液中活菌含量的计数   将上述各种活菌悬液用无菌吸管各吸0.1 ml于平皿（×2）中，用小牛血清琼脂倾注平板法计数活菌含量（37 ℃、5%CO2培养），作为冷冻试验前的基数。冷冻试验后，按规定时间，再吸出0.1 ml同法计数残存的活菌数。

1.4   冷冻保存试验   将上述各种计数后的活菌悬液置于4 ℃冰箱中（用水银温度计随时检测实际温度），冷冻24、48、72、96、144、192小时（生理盐水保存的菌种加测12小时结果），检测仍存活的细菌数量。

    1.5  人群带菌调查试验   在0岁、1~2岁、3~4岁、5~6岁、7~14岁、15~20岁和20岁以上年龄组的人群中各选择50人，每人用2根无菌棉签同时在咽部采集咽拭子，将采好的咽拭子1根放入小牛血清“双抗”培养基试管中（以下简称：新方法），带回实验室后再处理，另1根现场接种预温的巧克力色血琼脂平板（以下简称：常规方法），将平板保温状态下运到实验室后置37 ℃、5%CO2培养箱中培养18~24小时。带回实验室的小牛血清“双抗”培养基采样管，用接种环挑取两环，接种巧克力色血琼脂平板（无需预温），同上法培养，采样管置普通的37 ℃培养箱中增菌12~18小时后挑取一接种环，接种巧克力色血琼脂平板（无需预温），置37 ℃、5%CO2培养箱中培养18~24小时。培养到期后，挑取可疑菌落进行形态学和血清学等鉴定。

    2   结      果

    2.1   冷冻保存效果   冷冻保存前，A、C群脑膜炎奈瑟菌的生理盐水、脱脂牛奶、小牛血清“双抗”培养基制成悬液活菌含量分别为：2.4×106 CFU /ml、4×106 CFU /ml；6×105  CFU /ml、6.5×105 CFU /ml；7×105 CFU /ml、8.4×105  CFU /ml。冷冻保存12小时后，生理盐水中的A、C群脑膜炎奈瑟菌已检不出有活菌存在。脱脂牛奶、小牛血清“双抗”培养基的保存效果见表1。

    2.2   人群带菌调查效果   本次共检查了364人，其中0岁组49人，1~2岁组52人，3~4岁组50人，5~6岁组50人，7~14岁组52人，15~19岁组60人，20岁以上组51人。以上各年龄组的人应用常规方法均未检出脑膜炎奈瑟菌；应用新方法，增菌前直接接种检出1株B群脑膜炎奈瑟菌（该株菌在增菌后未能再检出），增菌后检出1株C群、2株B群和2株A群脑膜炎奈瑟菌，合计检出了6株，检出的菌株分布见表2。

    3   讨      论

高分子量的有机物能够提高微生物对不利的物理因素和化学消毒剂的抵抗力[3]。据此，我们设想用高浓度的小牛血清既作为脑膜炎奈瑟菌的保护剂，又为脑膜炎奈瑟菌提供更高的营养条件，这样可使脑膜炎奈瑟菌在寒冷的环境中能够被安全地带回实验室进行检测。根据实验结果，生理盐水中的脑膜炎奈瑟菌，4 ℃12小时内全部死亡。从表1可看出，在小牛血清“双抗”培养基或脱脂牛奶中，4 ℃24小时内，其活菌含量未见明显下降（t=0.25, P>0.05），至96小时仍有一大部分细菌存活，说明小牛血清“双抗”培养基或脱脂牛奶有很好的保菌效果。当活菌数下降至3~9 CFU/ml时，通过37 ℃培养18~24小时，可使活菌含量增加到(6~7)×107 CFU/ml，说明小牛血清“双抗”培养基或脱脂牛奶均有很好的增菌作用。但也要注意脑膜炎奈瑟菌的自溶现象[3]，如表1中显示的增菌后活菌数反而为“0”和1例样本在增菌前检出了B群脑膜炎奈瑟菌，而增菌后却未能检出，这一现象在我们的其它试验中遇见的机率大约在5%~10%，因此，液体培养基中的脑膜炎奈瑟菌在增菌前应先接种一次固体平板培养基，以防自溶使活菌全部死亡而降低检出率。人群带菌检查结果显示，应用小牛血清“双抗”培养基作采样时的保菌剂和检测时的增菌剂，有明显的提高脑膜炎奈瑟菌检出率的作用（χ2＝4.12, P<0.05）。上述结果说明了应用小牛血清“双抗”培养基建立起的新的脑膜炎奈瑟菌检测方法明显优于常规的咽拭子直接接种法。

作者：王海燕，邵荣标，毕诚，郑春早 

【参考文献】
[1] 闻玉梅，主编. 现代医学微生物学[M]. 上海：上海科学技术出版社，1999：258-259.
[2] 盐城市疾病预防控制中心. 小牛血清“双抗”培养基.中国:发明专利公报，200710019350.2[P]. 2007-08-08.
[3] 周正任,主编. 医学微生物学[M]. 第6版.北京:人民卫生出版社,2003:108,152

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