两种检测淋病奈瑟菌方法的比较

［摘要］ 目的：比较两种检测淋病奈瑟菌（NG）的方法。方法：采用荧光定量PCR检测法和NG培养法。对155例临床分泌物标本同时进行检测。结果：荧光定量PCR检测阳性率15.5%，培养方法阳性率4.5%.。两者比较PCR方法阳性率显著高于培养法（P<0.05）。结论：对NG的检测，荧光定量PCR检测法更适合，并且可有效减少假阴性。

　　［关键词］ PCR；淋病奈瑟菌；淋球菌培养

　　淋病是国内外最常见的性传播疾病之一,它严重影响着人们的身心健康,其病原体为淋病奈瑟氏菌(简称淋球菌，NG)。检测淋球菌的方法有很多，最主要的现在是聚合酶链反应（简称PCR）和细菌培养法两种。2005年下半年我们对155例门诊疑似患者取样进行了这两种方式的比较，通过统计学处理认为FQPCR法提高了淋球菌检测的准确性，也减少了淋球菌的漏检率。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　标本来源与采集　　　　　　

　　标本来源于我院2005年9月至12月日常妇科门诊和男性科门诊及泌尿外科门诊的155例疑似患者，年龄最大的59岁，最小的18岁，其中女性患者96例，男性患者59例。标本采集：男性用无菌拭子由前尿道2 cm~4 cm处取尿道分泌物，根据病情需要，也可取前列腺按摩液或精液。女性用女性拭子在宫颈管内1 cm~2 cm处取宫颈分泌物，在取宫颈标本时，应先用拭子将宫颈揩干净，再用另一个拭子取材。用拭子取材时，要在宫颈（或尿道）内旋转并至少停留20 s以上，以便获得较好的细胞。

　　1.1.2　仪器及试剂盒　　　　　　
　
　　荧光定量PCR仪为美国生产的ABI7000型，所用PCR试剂盒为深圳匹基生物工程股分有限公司生产；生物梅里埃公司生产的API NH奈瑟氏菌及嗜血杆菌鉴定系统。

1.2　方法

　　1.2.1　荧光定量PCR法　　　　　　　

　　取100 μl待测样本，加入100 μl DNA提取液1，振荡混匀。13 000 r/min离心15 min，吸弃上清（离心时注意离心管方向，尽可能吸弃上清且不碰沉淀）。加入50 μl DNA提取液2，振荡混匀。100 ℃干浴10 min，13 000 r/min离心10 min，保留上清待用（如标本裂解产物当天不使用，则保存于-20 ℃。按试剂盒配制试剂，加入处理好的标本上机进行PCR扩增。循环条件设置：37 ℃：5 min;94 ℃:1 min;95 ℃:5 s,60 ℃:30 s,40个循环。反应体系设为40 μl。

　　1.2.2　NG菌培养　　　　　　　

　　采用淋球菌巧克力培养基，按试剂盒操作要求将拭子进行接种，在5%CO2温箱35 ℃培养48 h~72 h。挑取可疑菌落进行革兰染色，如镜检可见革兰阴性肾形双球菌，则进行API NH奈瑟菌鉴定系统鉴定。该系统利用标准化及微量化试验并拥有与之相适应的数据库。API NH试验条有10个微孔管，内有干燥基质，可进行12项鉴定反应（酶反应或糖发酵），并能测青霉素酶。孵育时所发生的各种反应可通过自发或加入试剂后颜色改变测出。在35 ℃~37 ℃培养2 h后即可目视判读。参照使用手册的反应模式表即可得到结果。

　　1.3　统计学处理　　　　　　
　
　　对155例疑似患者所进行的荧光定量PCR法和细菌培养法检出率的比较分别用χ2检验。

　　2　结果

　　见表1。表1　两种方法检出结果（略）

　　3　讨论

NG是常见的性传播性疾病病原体，主要通过性接触直接感染泌尿生殖道、口咽部和肛门直肠黏膜，或在分娩时通过产道感染新生儿，临床表现为：单纯性淋病，临床症状为尿频、尿急、尿痛，尿道口脓性分泌物；子宫颈红肿、阴道分泌物增多和排尿困难；盆腔炎，表现为子宫内膜、输卵管、盆腔的淋菌性炎症；口咽部和肛门直肠病；淋菌性结膜炎，发生于新生儿产道感染，眼部大量脓性分泌物，治疗不及时可致盲；播散性淋病表现为畏寒、发热、皮肤损害和关节炎症，少量患者可致化脓性关节炎和脑膜炎。培养法检测NG，用于分离培养的标本直接接种于营养培养基中，立即置于5%CO2气体条件下35 ℃~37 ℃孵育48 h~72 h，再进行鉴定。虽然培养法的特异性和准确性都非常高，但由于标本取材不理想及标本中混有其他杂菌及NG离体后易死亡等因素均可能影响该菌的阳性检出率。漏检率因此也相当高，且不易作出早期诊断，临床医生不欢迎使用该法。荧光定量PCR法检测NG属一种基因诊断技术，它借助于一种DNA扩增技术，能将含微量的淋球菌标本处理扩增。自2002年1月卫生部下发了有关基因扩增检验技术临床应用的法规性文件《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发［2002］10号）和卫生部临床检验中心配发的《临床基因扩增检验实验室工作规范》（卫检字［2002］8号）以来，对临床PCR实验室进行了规范化管理和验收。在日常工作中严格执行质量保证体系中各种标准操作程序每次实验均做阴阳性对照，检验结果准确可靠，基本上杜绝了假阴性及假阳性的产生。本实验室通过NGPCR法和细菌培养法对155例门诊疑似患者同时进行荧光定量检测，并进行统计学处理得出了PCR方法阳性率显著高于培养法（P<0.05）。并且PCR方法检测时间短为临床医生所广泛接受。唯一的缺点是做不了该菌的药物敏感试验。

作者：黄明 

　　参考文献：

　　［1］Pierce KE,Rice JE,Sanchez JA,et al.L.Real time PCR using molecular beacons for accurate detection of the Y chromosome in single human blastomeres［J］.Mol Hum Reprod,2000,6(12).

　　［2］朱晓亮，曾抗.女性宫颈淋球菌3种检测方法比较［J］.临床皮肤科杂志，2004，33(3):171172.

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