青钱柳不同外植体组织培养及褐变防止的研究

【摘要】  　　目的探索青钱柳快速繁殖途径和褐变的防止方法。方法分别在不同季节采取青钱柳的嫩芽、带节茎段和嫩叶作为外植体，对外植体进行4种不同方式的处理后，接种到不同激素种类和激素组合的培养基中进行培养。结果春季取材更易诱导出愈伤组织和新芽；诱导茎段出芽的最佳培养基为B5+BA3.0 mg/L+NAA0.1 mg/L +IBA0.01 mg/L；适宜于嫩叶、嫩芽愈伤组织诱导的培养基分别为：B5+BA5.0 mg/L +NAA0.1 mg/L +IBA0.1 mg/L和B5+2，4－D1.0mg/L+BA0.1mg/L；外植体先于4℃低温预处理5 d和直接用烧红的手术刀快速切割外植体后再进行接种可有效减少外植体的褐变。结论青钱柳组织培养可诱导芽的产生和愈伤组织的形成。

【关键词】  青钱柳 组织培养 褐变

　　Abstract：ObjectiveTo study the rapid propagation and prevention of browning of Cyclocarya paliurus(Batal.)Ijinskaja. MethodsTender buds, nodular stem segments, and tender leaves were taken as explants in different seasons .The explants were treated in four different ways, and then cultured on different mediums.ResultsSpring was the best season for collecting and the most suitable medium for nodular stem segments to induce buds was B5+BA3.0 mg/L +NAA0.1 mg/L +IBA0.1 mg/L;as for tender leaves , B5+BA5.0 mg/L +NAA0.1 mg/L +IBA0.1 mg/L was optimum to induce callus, and B5+BA1.0 mg/L +NAA0.01 mg/L +IBA0.1 mg/L was the best for tender buds to form callus. Putting the explants under the condition of  4℃ for 5 days and cutting the explants quickly with a aglow scalpel before inoculating could decrease the browning effectively. ConclusionThe tissue culture of Cyclocarya paliurus (Batal.) Ijinskajacan can induce buds and callus .

　　Key words：Cyclocarya paliurus(Batal.) Ijinskaja；  In vitro culture；  Browning
   
　　青钱柳Cyclocarya paliurus(Batal.)Ijinskaja，系双子叶植物纲胡桃科青钱柳属植物［1］，又名青前李（江西）、山麻柳（四川）、甜茶树（贵州）、一串钱（湖北）等，是我国独有的单种植物，也是国家重点保护的濒危植物之一。据《中国中药资源志要》记载，其树皮、树叶具有清热解毒、止痛功能，可用于治疗顽癣。相关研究报道，青钱柳不仅含有人体必需的钾、钙、磷、镁等常量元素，还含有对人体具有保健作用的微量元素，被有关专家认为是可能治愈2型糖尿病的极佳良药［2］。
   
　　青钱柳种子具有深休眠习性，自然生长的青钱柳不仅数量少，且多零星分布于深山老林，自然更生率低，人工栽培青钱柳的成活率也不高［3］，严重影响了青钱柳的开发利用与产业化进程。因此，对青钱柳进行快速繁殖成为目前迫切需要解决的问题［4］。目前，有关青钱柳组织培养的报道并不多，且培养过程中也没有提及出现褐变现象［5,6］。本研究对不同外植体类型、不同季节取材、不同激素种类和激素组合等因素与青钱柳的组织培养的关系进行研究，探讨不同处理方式与青钱柳组织培养褐变的关系，以期寻找到青钱柳组织培养中芽及愈伤组织诱导的最佳方法，为青钱柳快速繁殖提供技术支持和参考依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料以7年生青钱柳植株当年抽生枝条作为材料，取材季节分为春、夏、秋季三季采摘。

　　1.2  方法 

　　1.2.1  外植体的处理 

　　对外植体设计4种不同的处理方式：①将外植体用剪刀剪成所需长度或大小（嫩芽长约2 cm；带节茎段约2.5 cm、叶片大小为1 cm2，以下同）后，进行消毒和接种作为对照组；②在接种的培养基中添加浓度为0.1%的活性炭；③外植体切成所需大小后于冰箱4℃低温下预处理5 d再进行接种；④将外植体用烧红的手术刀快速切割成所需大小后进行接种。

　　1.2.2  外植体的消毒和接种 

　　将外植体于洗衣粉水中浸泡20 min，流水冲洗1～2 h，接种前先在75％的酒精中浸泡20～30 s，无菌水冲洗3次后根据外植体不同类型用0.1％的升汞处理6～15 min，再用无菌水冲洗4次，在无菌条件下接种到培养基上，每瓶接种1个外植体，每一处理接种30瓶。每隔25～30 d继代1次。

　　1.2.3  培养基的设计
 
　　B5为基本培养基，附加3％的蔗糖和0.7％的琼脂。诱导芽的培养基为：① BA1.0+NAA0.01+IBA0.1；② BA3.0+NAA0.01+IBA0.1；③BA5.0+NAA0.01+IBA0.1；诱导愈伤组织的培养基为：④2,4-D1.0+BA0.1；⑤BA3.0+NAA0.05+IBA0.1；⑥BA3.0+NAA0.1+IBA0.1；⑦BA5.0+NAA0.1+IBA0.1（单位：mg/L）。培养基灭菌前将pH值调至5.8～6.0。

1.2.4  培养条件 

　　暗培养7 d后再转为光照培养，光照时间12 h/d，光强1 500～2 000 Lx。培养温度为（25±2）℃。

　　1.2.5  实验结果的统计和计算 

　　每一处理在接种后定期观察、记录外植体的动态和生长情况，在培养30 d分别统计接种数、褐变率、出愈数、出芽数、诱导率（注：接种数为去除污染后的数量，褐变率为褐变数与无污染的接种数的比值，诱导率为出愈数或出芽数与无污染的接种数的比值）。

　　2  结果

　　2.1  青钱柳不同外植体与芽的诱导的关系

　　本试验将嫩芽、茎段和嫩叶分别接种于培养基中，比较不同外植体诱芽情况，（见表1）。由表1可见，青钱柳的嫩芽、嫩叶均不能够直接诱导芽的产生，带节茎段在接种约7 d时叶柄基部有腋芽萌动，14 d时可见嫩绿的单芽长约0.4 cm，30 d时芽长为0.8 cm。说明同种植物的不同部位外植体诱导芽产生的能力是不同的。
  
　　在植物组织培养中，植物激素对器官的分化调节起重要作用，就形态学而言6-BA能够促进芽的分化［7］。从表1可见，诱导青钱柳芽抽生的适宜6-BA浓度为3.0 mg/L，诱导率为29.17％；BA为1.0 mg/L虽然可以诱芽，但诱芽率低，为4.35％；6-BA为5.0 mg/L则不能诱导芽的抽生。说明在诱导芽的生成时6-BA的浓度是一个关键因素，浓度过低诱芽率偏低，过高则抑制芽的抽生。
表1  青钱柳不同外植体与芽的诱导的关系（略）

　　2.2  不同季节采集的茎段对芽的诱导的影响将于春季、夏季和秋季采集的青钱柳茎段接种于BA3.0+NAA0.01+IBA0.1的培养基中，结果表明，春季采集的茎段能够诱导芽的抽生，出芽率可达29.17%；夏、秋两季采集的茎段出芽率和出愈率都比较低，且褐变率都大于50.00％（分别为82.61％和90.48％，见表2）。说明在春季采集不仅茎段的褐变率较低，而且更容易诱导腋芽的抽生和愈伤组织的形成。表2  不同季节的茎段对芽的诱导的影响（略）

　　2.3  不同激素组合对青钱柳愈伤组织的诱导效果的影响将嫩芽、茎段、嫩叶接种在不同激素组合的培养基中,不同外植体诱导产生愈伤组织的情况见表3。由表3可见，嫩叶在⑦号培养基上，其出愈率最好，最高可达93.33％；适合嫩芽诱导最高出愈率（为86.67％）的培养基为④号，适合茎段诱导出较高出愈率的培养基为⑥号（出愈率为42.85％）。说明不同激素组合的培养基均可诱导外植体产生愈伤组织，但不同外植体在不同培养基中诱导产生愈伤组织的效果不同。
   
　　表3结果还表明，不同外植体均可诱导产生愈伤组织，但其诱导产生愈伤组织的能力有差异，茎段的出愈率则比较低，最高仅为42.85％，嫩叶和嫩芽产生愈伤组织的效果较好，出愈率都高于60％，尤其是嫩叶，出愈率可达93.33％。说明幼嫩的外植体在愈伤组织的诱导方面具有优势，适合诱导愈伤组织的外植体为嫩叶和嫩芽。表3  不同激素组合的培养基与愈伤组织诱导的效果（略）

　　2.4  外植体的不同处理方式与褐变的关系在木本植物的组织培养过程中，褐变的问题是普遍存在的，因此有人认为褐变能否得到有效的控制是植物组织培养能否成功的关键［8］。胡冬南等［9］人报道青钱柳组织培养过程中无褐变现象，本实验对外植体进行了不同的处理，发现不同外植体在培养过程中存在褐变现象，但褐变程度不同：茎段褐变率最高，可达100%；嫩芽的褐变率较低；嫩叶几乎不存在褐变现象。说明不同类型外植体其酚类含量不同，越幼嫩的组织其含量越少，在组织培养中越不容易出现褐变现象。见表4。
   
　　本实验为探讨减少组织培养中茎段的褐变率，对外植体设计了4种不同的处理方式，结果表明，对照外植体在培养过程中有一定程度的褐变；将外植体先于4℃低温预处理5 d和直接用烧红的手术刀快速切割外植体后再进行接种可有效减少外植体的褐变率。分析其原因可能放置于4℃冰箱中，可使酚类物的氧化进程变慢，同时预处理5 d则有利于外植体切口愈合，在培养时可减少酚类物质的外溢；用烧红的手术刀片切割可以减少褐变，其原因尚不清楚。表4  不同处理方式与褐变的关系（略）

　　3  讨论

　　青钱柳的生理功用和药用价值已经引起人们的重视，探讨青钱柳的速繁途径和建立良繁体系成为目前迫切解决的问题。本试验研究表明,不同类型的青钱柳外植体在芽及愈伤组织的诱导率方面存在明显差异。就芽的诱导而言，春季采集的茎段在B5+6-BA3.0 mg/L+NAA0.01 mg/L +IBA0.1 mg/L的培养基上能够较好地诱导腋芽的抽生，其诱导率为29.17％；适合诱导青钱柳愈伤组织的外植体为嫩芽和嫩叶，适合培养基分别为B5+2,4-D1.0 mg/L +BA0.1 mg/L和B5+BA5.0 mg/L +NAA0.1 mg/L +IBA0.1 mg/L。

　　青钱柳组织培养中存在褐变问题，茎段的褐变情况最为突出，严重影响了芽及愈伤组织的诱导，防止褐变的方法在其他植物方面也有很多报道，本实验采取将外植体先于4℃低温预处理5 d后再进行接种能够有效减少外植体的褐变率；另外本实验首次采用烧红的手术刀对外植体进行切割再接种的方法，可将茎段的褐变率由100％降低至55.55％，为解决青钱柳的褐变问题提供了一种新的思路。

以上实验获得了大量较疏松、颗粒状、黄绿色愈伤组织和绿色致密的愈伤组织及一些青钱柳新芽，通过每隔25～30 d继代1次，愈伤组织能够一直保持活力；所诱导产生的新芽有部分在培养过程中却出现了新生叶子脱落或不同程度的褐变现象，影响了青钱柳的快速繁殖。因此，研究减少青钱柳组织培养中出现的褐变现象及如何从愈伤组织中诱导植株的再生，成为了今后重点解决的问题。

作者：吴群英 徐庆 李丽亚 梁荣感 龚受基《时珍国医国药》

【参考文献】
  　［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志，第21卷［M］.北京：科学出版社，1979：18.
　　［2］冷任轩.青钱柳的基础理论研究和临床观察［J］.江西中医药，1994,25(2)：64.
　　［3］郭春兰，杨武英，胡东南，等.青钱柳嫩枝扦插育苗等研究［J］.江西农业大学学报，2006，28(2)：254.
　　［4］徐 庆，宋芸娟.青钱柳的研究概况［J］.华夏医学，2004，17（3）：451.
　　［5］尚旭岚，徐锡增，方升佐.青钱柳离体胚的培养及快速繁殖［J］.南京林业大学学报（自然科学版）， 2007，31（1）：101.
　　［6］上官新晨，郭春兰，杨武英，等. 培养基及培养条件对青钱柳愈伤组织生长和黄酮含量的影响［J］.福建农林大学学报（自然科学版），2006，35（6）：588.
　　［7］Song,J.T., Choi,J,N., Song,S,I., et al Identification of a potexvirus in Korean garlic plants［J］.Agricultural chemistry and Biotechnolohy,1995,38(1):55.
　　［8］孔祥生，张妙霞，杜爱玲，等.甜柿离体快繁技术研究［J］.华中农业大学学报，1998，17（2）：178.
　　［9］胡冬南，蒋 艳，吴少福，等. 青钱柳组织培养的初步研究［J］.江西农业大学学报，2005，27（1）：39.

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