肉桂醛抗白假丝酵母菌实验研究

【摘要】  目的探讨肉桂醛抗白假丝酵母菌的作用。方法应用芽管实验、琼脂扩散法同步观察肉桂醛对白假丝酵母菌酵母型及芽管和假菌丝形成的影响，并用微量稀释法药敏试验测定其最低抑菌浓度。结果琼脂扩散法抑菌圈直径为25～37 mm，出芽率小于20%，其最低抑菌浓度(MIC)为250～500 μg/ml。结论肉桂醛具有较好的抗白假丝酵母菌作用。 
【关键词】  抗白假丝酵母菌作用; 肉桂醛; 芽管实验; 琼脂扩散法
中药肉桂为樟科常绿乔木的树皮，为临床常用的温里内服药物[1]。本课题组所作中草药对常见深部真菌的抑菌实验显示肉桂醇/水提取液对白假丝酵母菌兼有抑杀酵母型及抑制芽管和假菌丝形成的作用。为探讨其抗菌作用的主要成分，本实验应用肉桂的主要成分肉桂醛，采用芽管实验、琼脂扩散法同步观察肉桂醛对白假丝酵母菌酵母型及芽管和假菌丝形成的影响。现报告如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 菌种及药液配制将白念珠菌沙保氏平板48 h培养物用生理盐水洗脱，然后用血球计数法调整菌液浓度为1×108/ml。白念珠菌国际标准株(菌号：ATCC 14053)，北大医院真菌菌种保藏中心 (北京)提供。肉桂醛用最低量的二甲基亚砜溶解，无菌水稀释，肉桂醛的最终作用浓度为1 000～2 000 μg/ml及10 000 μg/ml，两性霉素B为16～0.3 μg/ml。 二甲基亚砜的终浓度低于1% 。
　　1.2 应用琼脂扩散法观察肉桂醛对白假丝酵母菌的抑制作用将白假丝酵母菌沙保氏平板48 h培养物用生理盐水配成1×109 •ml-1浓度菌液，用无菌棉签沾取菌液在沙氏平板上作均匀密集划线，5 mm孔径打孔器打孔，加入10.0 mg/ml肉桂醛药液0.05 ml，37℃温箱作用48 h，用直尺测量抑菌圈直径大小，以48 h完全不长菌作为测量标准，记录肉桂醛3孔抑菌圈直径的平均值(以抑菌圈≥10mm为有效)。
　　1.3 芽管试验对照管加0.3 ml新鲜家兔血清、0.3 ml生理盐水、0.05 ml菌液;试验管加0.3 ml新鲜家兔血清、0.3 ml肉桂醛(10.0 mg/ml)、0.05 ml菌液，各管混匀，置37℃水温箱作用4 h，用压滴法在低倍及高倍镜下观察出芽情况及细胞形态[加入0.05 ml菌液至对照管混匀后，立即在高倍镜下(400×)随机观察数个视野,每视野细胞数约为80～120个，试验管与对照管的菌液取自同一管]。
　　结果判定： 对照管以高倍10个视野均可见50%以上细胞出芽，随机计算10个视野≥20 μm (显微测微尺测量)菌丝的数量及均值，以均值>3为标准;试验管同样观察10个视野,以无出芽或出芽细胞数<20%且无≥20 μm的菌丝为有效。
　　1.4 微量稀释法测定药敏试验96孔细胞培养板紫外线照射30 min后，于每板第1排各孔(12孔)内分别加人培养基180 μl，第11孔为阴性对照，第12孔为阳性对照;系列稀释浓度的待测药液10 μl依次加人相应药液于各孔中，阴性对照中加20 μl，加入制备的真菌溶液10 μl(阴性对照孔不加)，使最终菌量为0.5×103～2.5×103 cfu/ml，振荡5 min使各液充分混匀，35℃温箱培养(湿盒内保持液量)48 h观察。未见菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度(MIC)。
　　2 结果
　　2.1 琼脂扩散法实验重复3次，发现肉桂醛具有较好的抗白假丝酵母菌酵母型作用，每次结果都可见抑菌圈≥10 mm。见表1。
　　2.2 芽管试验实验重复3次，发现肉桂醛具有较好的抑制白假丝酵母菌芽管及菌丝的形成，其出芽率小于20%，且无长度≥20μm的菌丝出现。见表1。
　　2.3 微量稀释法测定药敏实验经药敏试验发现肉桂醛的最低抑菌浓度为250 μg/ml(2次)及500 μg/ml(1次)。见表1。表1 肉桂醛抗白假丝酵母菌实验研究结果
　　3 讨论
随着广谱抗生素，皮质类固醇激素和免疫抑制剂广泛应用及放射性医学不断发展，病原菌与宿主之间的关系在不断发生变化，体内环境平衡紊乱，菌群失调，致使内脏真菌病发病日益增多。目前治疗深部真菌感染的药物种类少，且多具毒性，使深部真菌感染难以控制，故寻找与开发无毒、高效的抗深部真菌药物十分必要。

白假丝酵母菌是最常见的条件致病性真菌，在检出致病性真菌中占首位[2，3]，其既常引起皮肤粘膜的感染，又常致肺、支气管、肠道等深部组织器官的感染。白假丝酵母菌为酵母型真菌，其具有酵母型及菌丝相两种形态，但其只有发育成菌丝相形成假菌丝时才致病[4]，体外试验发现菌丝长度大于20 μm时常具抗吞噬作用，故假菌丝是其重要致病因素。新近发现白假丝酵母菌对组织细胞的粘附力也与芽管的形成密切相关，当其芽管形成后，明显增加细胞表面的疏水性[5]，疏水的白念珠菌显示出明显的粘附力[6～8]。白假丝酵母菌的粘附是其侵袭和定居的先决条件，芽管是其粘附的物质基础，也是形成假菌丝的前提。
　　琼脂扩散试验是常用的药物筛选方法之一，但由于白念珠菌在琼脂培养基上主要为酵母相，故该法只反映药物抑制了白念珠菌酵母相的生长，而不能反映药物对白念珠菌菌丝相的影响。为此，本研究将芽管试验应用于抗真菌药物的筛选，其依据是白念珠菌在含有血清的培养基可由酵母相发育为菌丝相，当加入试验药物后，可阻止白念珠菌发育为芽管或假菌丝，从而能反映药物对白念珠菌致病物质的影响，对药物的筛选有重要意义。
从研究结果可以看出，肉桂醛具既能抑制白假丝酵母菌的酵母相，又能有效抑制其出芽及芽管形成。然而，其最低抑菌浓度较高，如要真正应用于临床，是否要对其进行改构或化学修饰。
 

作者：朱贤森，黄晓东，黄志勤《时珍国医国药》

【参考文献】
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　　[3] 陈淑敏,傅冠峰,刘 苏,等.医院真菌感染34例调查分析[J].中华医院感染学杂志，1997,7(1)：221.
　　[4] 闻玉梅,陆德源.现代微生物学[M].上海:上海医科大学出版社，1990：202.
　　[5] Rodrigues AG,Mardli PA Pina-Vaz C,et al. Germ tube formation changes surface hudrophobicity of Candida cells[J]. Infect Dis Obstet Gynecol, 1999, 7(5):222.

　　[6] Blanco MT,Blanco J,Sanchez-Benito R,et al. Incubation temperatures affect adherence to plastic of Candida allbicans by changing the cellular surface hydrophobicity[J]. Microbiol, 1997,89 (358): 23.
　　[7] Wellmer A.Adhesion of clinical Candida albicans isolate to buccal epithelial cells[J]. Mycoses, 1999 ,42 (Suppl 1):43.
　　[8] Lyman CA,Navarro E,Garrett KF,et al.Adherence of Candida albicans to bladder mucosa: development and application of a tissue explant assay[J].Mycoses,1999, 42(4): 255.

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