金银花水提物对双歧杆菌与乳酸杆菌体外生长的影响

【摘要】  　　目的探讨金银花水提物对双歧杆菌、乳酸杆菌体外生长的作用。方法制备金银花水提物浓度为50%，25%，12.5%，6.25%，3.125%，2%，1.0625%的BL肉汤和MRS液体培养基；取两歧双歧杆菌Bif1101和保加利亚乳酸杆菌标准株悬液在药物培养液中生长后接种到平板，作平板菌落计数；不同培养时间点测定稀释10倍后含不同浓度金银花水提物的细菌培养液和对照组细菌培养液的吸光度（A）值，计算各培养基吸光度增加值（D A）；测定细菌培养液20，24 h 时的pH值。结果当金银花水提物浓度＜6.25％时，则显著高于对照组；金银花水提物浓度＞6.25%，则显著低于对照组；乳酸杆菌培养液和双歧杆菌培养液20，24 h的D A分别在金银花水提物浓度≤6.25%和≤3.125%时高于对照组；金银花水提物浓度＜6.25%时，则pH值显著低于对照组；而金银花水提物浓度＞6.25%时则相反。结论低浓度金银花水提物可以促进双歧杆菌、乳酸杆菌在体外的生长。高浓度金银花水提物则抑制双歧杆菌、乳酸杆菌在体外的生长。

【关键词】  金银花； 双歧杆菌； 乳酸杆菌； 双歧因子； 益生菌

　　双歧杆菌和乳酸杆菌是胃肠道正常微生物区系中的重要有益菌并与宿主终生伴随，发挥营养、免疫调节、生物屏障、维持肠道菌群平衡等重要作用［1］。临床上发现应用双歧杆菌、乳酸杆菌可以调节机体免疫、辅助治疗或预防严重感染、多种胃肠道炎症、过敏性疾病［2，3］。而现代药理学的研究发现［4，5］许多中药和植物含有促进双歧杆菌、乳酸杆菌生长的成分。现代微生态学研究表明［6］含有多糖类的中药多具有双歧因子(bifidus factor, BF)作用，可促进双歧杆菌、乳酸杆菌的生长。金银花性寒味甘，其水溶剂提取物含有葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等多糖类物质［7］。本实验对金银花水提物在体外对双歧杆菌、乳酸杆菌生长作用进行了研究。

　　1  材料

　　1.1  药物来源金银花购自贵州省中药材公司，经重庆医科大学药学系生药教研室鉴定为黄褐毛忍冬。取生药300 g制成300 ml流浸膏，定为100%浓度。

　　1.2  菌种来源两歧双歧杆菌Bif1101 (Bifidobacterium bifium)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgraticus)由重庆医科大学检验系临床微生物学教研室提供。

　　1.3  培养基BS培养基、 LBS培养基、 BL肉汤培养基和 MRS液体培养基均自制。

　　2  方法

　　2.1  药物液体培养基的制备将BL肉汤和MRS液体培养液稀释为金银花水提物浓度为50%，25%，12.5%，6.25%，3.125%，2%，1.062 5%的药物液体培养基。将不同浓度金银花水提物BL肉汤和MRS培养液的pH值分别调至7.22，6.25，5 ml/管分装，每一浓度12管。同时以5 ml/管无金银花水提物的BL肉汤和MRS液体培养液各12管（ pH值分别调至7.22，6.25）作为对照组。

　　2.2  菌液的制备两歧双歧杆菌Bif1101和保加利亚乳酸杆菌经庖肉基复活后，各取一定的纯菌液分别接种于5 ml BL 肉汤和5 ml MRS液体培养基中，37℃，48 h厌氧培养后，无菌生理盐水水洗3次（2 500 r/min×5 min），用麦氏比浊管调整菌液浓度为6×108个/ml，经纯菌检查证实为无污染的纯细菌悬液。

　　2.3  指标

　2.3.1  平板菌落计数取含不同浓度金银花水提物的药液培养基和对照管，分别加入制备好的双歧杆菌、乳酸杆菌悬液0.1 ml，厌氧培养24 h。分别从管中取培养液0.1 ml，用大便稀释液将其依次进行10倍稀释至10-7，每管选取3个稀释度，厌氧培养48 h后作平板菌落计数。细菌的活菌数用对数表示为Log10CFU，活菌数= Log10［均菌落数（滴）×50（滴）×稀释倍数］。

　　2.3.2   吸光度（absorbency, A）双歧杆菌组和乳酸杆菌组分别在波长610，560 nm处测定刚接种好菌液的不同浓度金银花水提物的药液培养基和对照组培养基，稀释10倍后的A值即A0 h。取同样的双歧杆菌、乳酸杆菌细菌悬液按0.1 ml/管接种至不同浓度的BL肉汤、MRS液体培养基，厌氧培养20，24 h，测定各管培养液稀释10倍的A值即A 20 h，A 24 h，求出各培养基在0～20 h，0～24 h的A增加值（D A值），即D A 20 h= A 20 h- A 0h， D A24h= A24h- A0 h。 令E=D A样品- D A对照，当E﹥0，提示对细菌有增殖作用；若E≤0，提示对细菌无增殖作用［4］。

　　2.3.3  pH值含不同浓度金银花水提物的药液培养基和对照组培养基各12管，分别加入制备好的双歧杆菌、乳酸杆菌细菌悬液0.1 ml，厌氧培养24 h。于20，24 h时测定培养液的pH值［8］。

　　2.4  统计学处理采用SAS 8.1统计分析软件包。实验结果以±s表示，各组样本间数据方差齐性，采用单因素方差分析。以P<0.05判定有无显著性差别。

3  结果

　　3.1  双歧杆菌、乳酸杆菌平板菌落计数金银花水提物浓度为6.25%，双歧杆菌、乳酸杆菌菌落计数与对照组无显著差别；金银花水提物浓度＞6.25%，双歧杆菌、乳酸杆菌菌落计数降低；金银花水提物浓度＜6.25%，双歧杆菌、乳酸杆菌菌落计数增加。见表1。表1  各组双歧杆菌、乳酸杆菌的平板菌落计数比较(略)

　　3.2  双歧杆菌、乳酸杆菌E值当金银花水提物浓度≤6.25%，乳酸杆菌组E＞0；当金银花水提物浓度＞6.25%，乳酸杆菌组E＜0。当金银花水提物浓度≤3.125%，双歧杆菌组E＞0；当金银花水提物浓度＞3.125%，双歧杆菌组E＜0。见图1～2和表2。表2  各组双歧杆菌、乳酸杆菌20，24 h 的E值比较（略）

　　3.3 双歧杆菌、乳酸杆菌pH值金银花水提物浓度为6.25%，双歧杆菌、乳酸杆菌培养液20，24 h的pH值与对照组间无显著差别；金银花水提物浓度＜6.25%，双歧杆菌、乳酸杆菌培养液20 ，24 h的pH值显著降低；金银花水提物浓度＞6.25%，双歧杆菌、乳酸杆菌20，24 h 的pH值显著增加。见图3～4和表3。表3  各组双歧杆菌、乳酸杆菌20，24 h 的pH值比较(略)

　　4  讨论

    乳酸杆菌和双歧杆菌是人体内最多、最常见的生理性细菌，发挥营养、生物屏障、免疫调节和免疫增强、维持肠道微生态平衡、抗肿瘤和辐射、抗衰老、降低血液胆固醇、减轻肝脏负荷等［1，2，9，10］多种生理效应。双歧杆菌［11］对营养要求较高，以葡萄糖等单糖和一些低聚糖等有机碳源作为碳源和能量，最适宜的氮源是蛋白质水解产物如蛋白胨、肽类和氨基酸等。双歧杆菌生长需要铁、磷、硫、钠、钾、钙、镁、锰、锌等矿物元素和一些辅助生长因子，如维生素、嘌呤、嘧啶及其衍生物、双歧因子等。乳酸杆菌营养要求严格，除了碳水化合物，还需要多种氨基酸、维生素、肽类等。许多研究发现不少传统中药可以作为双歧因子促进双歧杆菌、乳酸杆菌增殖的作用［5，6］。

    本文结果提示金银花水提物对双歧杆菌、乳酸杆菌的作用有非常明显的浓度效应现象,即当金银花水提物浓度＞6.25%时，表现对双歧杆菌、乳酸杆菌体外生长抑制，且抑制作用随浓度增加有增强的趋势；当金银花水提物浓度＜6.25%时，表现为促进双歧杆菌、乳酸杆菌体外生长,且其增殖作用随浓度增加有所增强的趋势。推测在金银花水提物浓度＜6.25%时，金银花含有葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等多糖类物质［7］，游离氨基酸和多种微量元素等［12，13］成分可以促进双歧杆菌、乳酸杆菌生长。尽管金银花水提物浓度低，但可溶性糖含量较高。有研究显示金银花含量总糖［14］可以达26.87%,其中可溶性糖含量高到23.65%，故低浓度可以促进双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖。虽然金银花也含有绿原酸等［14］抑菌成分，但是抑菌成分难以直接溶于水溶液中，如绿原酸在水中的溶解度为4%，故金银花水提物浓度＜6.25%时抑菌成分含量较低时，不能对细菌生长起显著的作用。然而金银花水提物浓度＞6.25%时，金银花水提物中的抑菌成分含量足够使其抑菌成分对双歧杆菌、乳酸杆菌体外生长起主要作用，且抑菌成分含量随浓度增加而升高,这与金银花还含有绿原酸、异绿原酸、木犀草素等［14，15］ 抑菌成分有关。金银花中绿原酸的含量［15］ 为4.29～6.07%，是主要的抑菌成分。平板菌落计数法和测定pH值法的结果均提示6.25%浓度金银花对双歧杆菌、乳酸杆菌生长的增殖和抑制作用均不明显，这可能由于6.25%浓度金银花的增殖或抑菌作用相互抵消，其表现出增殖或抑菌作用不显著；然而测定OD值法的结果显示6.25%浓度金银花对双歧杆菌生长的有抑制作用，对乳酸杆菌有增殖作用。A值小数点后第3位数的变化完全可能是仪器的轻微变化所致，故6.25%这一浓度实际也可以认为是一转折浓度，与其他实验结果基本一致。

本研究显示金银花水提物对双歧杆菌、乳酸杆菌有浓度效应，低浓度促进增殖，且毒副作用小，将可能在一定程度上解决抗生素带来的副作用，并在防病治病、调节免疫、平衡肠道菌群等方面发挥一定作用。

作者：冉域辰，黎海芪，刘明芳《时珍国医国药》

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