大肠杆菌变种的分子生物学检测方法研究进展

大肠杆菌是最常见的微生物之一，在自然界广泛分布，在动物体内也存在。它具有易培养、生长快、易变异等特点。肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E. coli，EHEC)是大肠杆菌的一个变种，曾在多个国家暴发流行。目前美国、加拿大等国家也出现了新的耐药性变种［1］，导致了多人死亡。因此大肠杆菌致病变种引起了国内外学者的密切关注，并对大肠杆菌变种进行了深入的研究。笔者以EHEC血清型O157：H7为例，对它的分子生物学检测方法进行综述，为对该菌引起的疾病进行预防、诊断和治疗提供参考依据。

    大肠杆菌 O157：H7 曾多次在世界各地，特别是发达国家引起广泛的暴发流行。感染主要导致腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)，并经常伴发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)、血栓形成的血小板减少性紫癜( thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP) 并发症，严重威胁着人类的生命健康［2］。人类感染此菌的途径主要是食用或接触污染的牛肉、蔬菜、水果及水源等。
   
　　EHEC菌株能产生毒素，编码这些毒素的基因包括志贺菌素1基因(st x1)、志贺菌素2基因(st x2)、大肠杆菌粘附与消除基因(eae)和肠溶血素基因(ehx)等。大肠杆菌O157:H7是与人类疾病相关的最常见血清型细菌。1982年，美国学者首次从出血性腹泻患者的粪便标本中分离到该菌，并报道与食用汉堡牛肉饼有关。这是人类第一次认识到大肠杆菌O157:H7可作为一种病原菌使人类致病，但当时并没有引起医学界的足够重视。此后，大肠杆菌O157:H7引起的感染在美国、加拿大、英国和日本等发达国家迅速增加,逐渐引起广泛重视。我国于1987年由权太叔等首次从出血性结肠炎患者粪便中分离到O157:H7大肠杆菌。此后，福建、浙江、广东、河北、宁夏等十几个省陆续分离出该菌。为防止类似事件出现，1997年5月建立了全国O157:H7大肠杆菌检测网络。
   
　　大肠杆菌O157:H7对人的致病力较强，每克感染载体含菌10个以上即可能引起感染。因此，在流行病学调查中，特异、灵敏及快速检测O157:H7的方法显得尤为重要。随着分子生物学技术的迅速发展，使得快速、准确检测O157:H7成为可能，并为该领域的研究开拓了更广阔的前景。

　　2.1 聚合酶链反应(PCR)技术 

　　该技术是最常用的检测大肠杆菌O157:H7致病基因的方法。目前已从单一PCR发展到多重PCR乃至实时荧光定量PCR（RQ- PCR ）。Paton 等［3］采用多重PCR 方法扩增st x1 、st x2、eae、ehxA和saa基因，发现所检测的ETEC(大肠杆菌O157:H7是其中一种)中，有几种或全部为致病基因。Fey 等［4］ 对335份腹泻患者的粪便样品进行选择性细菌培养，再从中选择可疑菌落进行检测。用多重PCR的方法检测到14株ETEC，与联合应用传统的细菌分离培养和酶免疫法(enzyme immunoassay，EIA)相比，分离的菌株数相同。从而证明，PCR是一种与细菌常规分离培养和EIA联合应用、具有相同敏感性和特异性的方法。由于其速度快，可作为一种诊断由EHEC感染引起腹泻的替代方法。

    近年来，随着RQ-PCR的发展，这种技术也被用于大肠杆菌O157:H7的检测。RQ-PCR是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。常规PCR技术只能对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，也无法对扩增反应进行实时检测。RQ-PCR通过对引物、探针或扩增产物进行荧光标记使对积累的扩增产物进行实时检测成为可能。Ct值即PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。朱海等［5］使用RQ-PCR检测生果、蔬菜中大肠杆菌O157∶H7，说明荧光定量PCR检测方法比传统分离培养法灵敏度更高。Bellin等［6］在45min内用这种方法检测了32个EHEC菌株中的st x1和st x2基因，证明实时定量PCR是一种快速检测EHEC的方法。同时，该试验对重复结果为阴性的试验也较为迅速。

    因此，这种方法在处理大量怀疑含大肠杆菌O157:H7样品时可使用，如在临床微生物中粪便分析或食品安全性检验中的应用。

    运用PCR方法检测与疾病相关的毒素基因还有助于对疾病发病机理的了解。有研究表明［6］，从ETEC感染患者体内分离的EHEC中，大部分含有与毒力相关的90kb质粒编码的ehxA基因。从引起出血性肠炎和HUS患者体内分离的EHEC中含有st x2和eae基因，而从无症状携带者分离的EHEC缺少eae基因，说明缺少eae基因也就使ETEC缺乏了肠上皮细胞的粘附机理。

　　2.2  限制性片段长度多态性(RFLP) 

　　RFLP是根据不同样品(个体)基因组或某个基因的限制性内切酶的酶切位点之间发生了碱基的替换、重排、插入、缺失等，导致产生新的限制性酶切位点或丢失某些酶切位点。新切点的出现可使限制性片断的长度缩短，而旧切点的丢失可使限制性片断的长度增大。通过基因的PCR扩增、限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，在紫外光下直接观察，可比较不同样品(个体)DNA水平的差异(即多态性)。RFLP是目前细菌亚分类最常用的方法之一，该法也被成功用于大肠杆菌O157:H7的多态性分析。Zhang等［7］用PCR-RFLP对从人分离的大肠杆菌st x1基因的变化情况进行了分析，从有腹泻症状的患者分离的大肠杆菌中检测到st xB1，无症状携带者分离的大肠杆菌中检测到st xB1的等位基因(命名为st xB1c ) 。用限制性内切酶FspⅠ酶切282bp 的st xB1及st xB1c、st xB1 酶切的结果得到189bp和93bp两个片段；st xB1c没有被切开，用限制性内切酶HhaⅠ进行酶切，st xB1得到135bp、92bp和55bp 3个片段；st xB1c得到218bp和64bp两个片段。选择包括EDL933 的共6个菌株(均有st x1)作对照试验，酶切的结果与st xB1一致。从上述结果可见，只运用PCR技术无法解释相同病原菌编码相同基因引起感染却出现不同症状的情况，RFLP 方法为大肠杆菌O157致病机理的研究提供了一条更加有效的途径。

　　2.3  随机扩增多态性DNA(RAPD) 

　　RAPD建立在PCR基础上，使用一系列具有10个碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测其多态性。分析时所用引物数很大，虽对每一个引物而言，其检测基因组的DNA多态性区域有限，但利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA 进行多态性检测。目前该项技术也被用于大肠杆菌O157:H7的多态性检测。Radu等［8］对从15份牛肉和3份鸡肉样品中分离出的28株O157:H7分别进行RAPD和PFGE分析，并绘制了进化树。RAPD将其分为两个组群，22个亚组群，PFGE将其分为两个组群，28个亚组群。Johnson等［9］对日本京都一家工厂暴发的大肠杆菌O157：H7感染调查中，也分别用RAPD和PFGE对从患者粪便中分离的O157：H7进行了多态性分析，并与在东京暴发流行该病时分离的菌株进行比较，发现两者的结果没有差异。在以PCR技术为基础检测DNA多态型的众多方法中，RAPD是一种快速、简单的方法。它为大肠杆菌O157：H7提供了一种高效区分不同亚组群的方法。虽然相对于PFGE其区分能力略逊一筹，但它快速简单，不像PFGE需要较长时间，可作为PFGE方法的参照。另外，RAPD对DNA的要求不高，只需少量模板就可用于扩增反应，适用于从食物样品和粪便中分离的多个菌株的分析。

　　2.4  随机片段长度多态性(AFLP) 

　　AFLP技术由Zobeau 等于1992 年创立。该方法结合了RFL P 和RAPD 技术的特点，利用两种或两种以上的酶切割DNA ，形成不同酶切位点的限制性酶切片段，在所得的酶切片段上加上双链人工接头，作为PCR 扩增的模板。对于PCR的引物，AFLP作了修饰,将引物与酶切片段识别序列结合起来，其引物从5′→3′依次为核心序列、酶切识别序列、3′端选择碱基序列。而核心序列与人工接头互补，从而实现选择性扩增。DNA 片段经两种或两种以上的酶同时切割，如果遗传特性发生改变，则酶切片段数目、长短发生变化，从而实现多态性。Iyoda等［10］分析了46株大肠杆菌O157:H7和其他血清型大肠杆菌O26：11、O114：19、O119：N，结果显示，同一地区暴发分离的大肠杆菌O157：H7菌株的AFLP条带结果具有同一性，在亚分类时可将其归入同一组群。该结果与脉冲凝胶电泳得出的结果一致。Zhao等［11］利用该方法对48株O157:H7进行了分析，并在每对引物的一条引物带上标记荧光素，以便进行仪器解读，称为荧光AFLP(FAFLP)，共获得37种不同基因组的DNA指纹，PFGE获得21种，说明FAFLP在一定条件下可以提供更详细的PFGE不能区分的DNA样品指纹图。

　　Smith等［12］通过对71株O157进行FAFLP分析表明，FAFLP较目前的分子生物学分类方法在理论上更为先进，实际操作中更易于标准化。与PFGE方法相比，它可得到的大量更为详尽的数据，扩增片段可精确到±1bp。在相同的消化连接反应中，通过使用不同的选择性引物，可提高或降低其鉴别能力。

    AFLP技术与RAPD技术一样,能产生丰富的多态性，但RAPD技术是在高Mg2+浓度、低复性温度、短引物序列(10bp)允许引物与模板错配等不严格条件下进行扩增，结果易受外界因素的影响，重复性较差［12］。AFLP技术则不同，引物与模板严格配对的碱基数多达17个，且在56℃退火温度下进行，其结果的可靠性高于RAPD。而RFLP等技术需要预先制备相应的DNA探针并进行杂交，才能得到较低多态性的结果［13］。AFLP技术克服了上述两种方法的缺点，即能获得较好的多态性,并且实验结果稳定、可靠、重复性好、分辨率高［14］。但AFLP技术也存在一些不足,如成本高、酶切条件及引物需要筛选、所需时间略长。

　2.5  脉冲场凝胶电泳(PFGE) 

　　PFGE的基本原理是通过电场的不断改变，使包埋在琼脂糖凝胶中的DNA分子的泳动方向做相应改变，小的DNA分子比大的变化快，故小分子泳动得快，从而在凝胶上按染色体大小而呈现出电泳带型。DNA带的密度在一定程度上反映了细菌内DNA的含量以及DNA分子的大小，最终达到分型的目的。

    PFGE常用于基因组DNA的分析，是目前分子流行病学调查最经典的方法［15］，已成功用于众多微生物的遗传性分析［16］，被世界上许多实验室作为菌株基因分型的参考方法，是迄今最常用的亚分类方法。目前对病原细菌常用的分子生物学分型方法有：RFL P，特定片段PCR，RAPD，基因外重复回文序列PCR(Rep-PCR)，裂解酶片段长度多态性(CFLP)，扩增片段长度多态性(AFLP),Multiple-locus variable-number tandem repeats analysis,MLVA)以及Multiple-locus sequence typing,MLST)多位点序列分析等。PFGE与以上方法相比，具有重复性好、分辨率高［17］、结果稳定、易于标准化的优点，能在细菌基因组很庞大的情况下，尽可能反映较多的变异信息。但是也存在一定的缺点［18］，比如耗时；电泳带型易受人为等多种因素的影响；并不是对所有情况都适合；不能同时优化胶的每个部分的条带分布；不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段；不同条带之间并不是无关的、相互独立的，而是互相联系的；一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化；结果不易分析，没有国际统一标准，不易于在实验室之间进行比较，且仪器价格昂贵。

    PFGE适用于检测较罕见的限制性内切酶产生数量较少，而片段较大的DNA片段，这些片段因分子量较大，常规电泳不能将其分开，但可用一个不断变化的(脉冲)电场将其分开。美国国家公共卫生实验室已完成了PFGE标准化流程的制定，并在多次不同的O157:H7暴发流行中应用。Xu等［19］从113只金龟子中分离到4株大肠杆菌O157:H7，从383份腹泻患者粪便中分离到10株大肠杆菌O157:H7。对分离到的14株O157:H7进行基因组DNA PEGF分析，其中4株从金龟子分离的O157:H7与9株从腹泻患者分离的O157:H7 PEGF的结果一致，从而证明14株O157:H7具有相同的起源。金龟子可能通过接触粪便而携带大肠杆菌O157:H7，并在粪便运输过程中传播该菌。Kruger等［20］对分别来自牛(59株)、羊(4株)和腹泻患者(33株)的大肠杆菌O157进行RAPD-PCR和PFGE分型。RAPD-PCR结果显示，总共96株菌只是在条带的亮度上有所差异，具有高度的单形性；PFGE结果则可将96个菌株分为76个不同的基因组形式，证明了PFGE在基因分型中的优势。Radu等［7］从食品中分离大肠杆菌O157进行的基因分型试验也证明了PFGE的优越性。PFGE已被证明，在大肠杆菌O157:H7的分子流行病学调查中是一种可靠的分型方法。

　　2.6  多位点可变数衔接重复序列分析(MLVA)
 
　　MLVA多用于哺乳动物亲缘关系的分析，近年来也被用来作细菌多态性检测，已有多种细菌采用该方法进行分型，如炭疽杆菌［21］、耶尔森菌［22］、结核分支杆菌［23］。在真核生物基因组中存在大量的数目可变的衔接重复序列(variable number tandem repeat，VNTR)。VNTR是由几个核苷酸(最常见为2～4个)作为核心序列串联重复形成的DNA序列，在原核生物基因组中也发现了这种序列，但它的一般长度不到原核生物基因组的1/10。这种序列可存在于原核生物基因中，也可存在于基因之间。大肠杆菌O157：H7中发现，有7个VNTR，重复数从6～30个碱基不等，其中6个存在于染色体DNA上，另一个存在于编码毒力基因的质粒上。通过不同菌株基因组核心序列串联重复数的差异，可检测大肠杆菌O157：H7的多态性。Lindstedt等［24］用MLVA方法，将69株大肠杆菌O157分为45个不同型别，用PFGE方法将它们分为44个，证明ML2VA与PFGE相比具有相同的灵敏度和更高的特异性，具有很多优点。首先，它无需抽提基因组DNA；其二，该法重复性好，即使不同实验者也可得到相同的条带形式；第三，可制定统一标准，易于各实验室间进行比较；第四，能在较短时间内处理大量样品。运用分子生物学分型方法检测大肠杆菌O157：H7的多态性，为调查其是否潜在暴发流行提供了有效手段。菌株的分型使得研究食品工业中O157：H7的污染检测也更为方便，关键控制点易于找到，使得有适当措施被贯彻来保证食品的安全。

综上所述，大肠杆菌O157：H7有多种分子生物学检测方法。不同的方法各有优缺点，我们应该根据检测目的和实验室拥有的条件选择最适合的方法进行检测以及其他研究。

作者：黄衍强  右江民族医学院微生物学教研室

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