幽门螺杆菌耐药的分子机理研究进展

幽门螺杆菌（helicobacter pylori，HP） 与胃、十二指肠疾病密切相关，是消化性溃疡、慢性活动性胃炎、十二指肠球部溃疡重要致病因素，也是胃癌演变的始动因子，与胃淋巴瘤的发生、发展有一定的关系［1］。HP清除直接关系到上述疾病的转归。但随着抗生素的广泛应用，其耐药率逐年上升。因此，探讨HP的耐药分子机理，对指导临床合理用药，有效控制HP相关疾病的传播有着十分重要的意义。

　　1  HP耐药性的产生   

　　治疗HP感染的药物有咪唑类如甲硝唑，大环内酯类如克拉霉素，β-内酰胺类如阿莫西林、喹诺酮类、四环素与硝基呋喃类等。关于HP耐药的起源，现代微生物学认为有两种可能性：①自发突变学说，即耐药性的产生是由于菌株的自发突变。根据达尔文的进化论，随着抗生素的应用，抗生素敏感的细菌逐渐减少而耐药菌逐渐增多；②耐药遗传信息的传递产生了新的耐药株。染色体DNA 或质粒基因上有控制耐药性的遗传信息，HP耐药基因在细菌DNA重组时进入敏感菌株，从而使耐药菌株增加。

　　2  HP耐药的分子机理   

　　细菌对抗生素的耐药可能与菌种的特性有关，也可能通过菌株的变异或者基因的转移获得，后者主要涉及到：①细菌产生灭活酶或钝化酶；②药物作用的靶位改变；③细胞膜的渗透性改变；④细菌对药物的外排和生物被膜的形成。HP对不同抗生素的耐药主要与以下机理有关：

　　2.1  HP对甲硝唑的耐药  甲硝唑是一种具有抑菌活性的药物前体，由于其氧化还原电势较低，易被硝基还原酶还原为亚硝基衍生物、羟氨衍生物，还原产物具有细胞毒性，使细菌DNA降解、断裂甚至导致细菌死亡。因其杀菌活性不受胃内低pH的影响，在胃腔内浓度高，具有较强的抗HP活性，因此常用于HP感染的一线治疗。但是近年来，随着甲硝唑的广泛使用，HP对甲硝唑的耐药率逐年上升。在发达国家HP对甲硝唑的耐药率为20％～30％，而发展中国家高达60%～80%［2，3］。HP对甲硝唑耐药主要与rdxA基因突变导致该基因的失活有关，rdxA是编码氧不敏感的烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸硝基还原酶基因。但Kwon，Marais［4，5］研究证实frxA、fdxA、fldA、fdxB、oorDABC和porCDAB等基因也参与了HP对甲硝唑的耐药，并证实frxA、fdxB 和rdxA 基因的失活不会对HP产生致死效应，而fdxA、fldA、oorDABC 和porCDAB基因的失活却会导致HP的死亡，这可能与这些基因编码的蛋白为HP的存活提供了一个微需氧环境有关。同时也发现单一fdxB基因突变导致HP对甲硝唑的低水平耐药甚至不导致耐药，但当rdxA 基因与fdxB联合突变时将导致高水平耐药，而frxA或rdxA 基因的突变均会产生中等水平耐药，但当两者同时突变时则产生高水平耐药。国内李耿等［6］研究也表明HP对甲硝唑耐药不仅与rdxA有关，同时与frxA、fdxB基因突变有关。

　　2.2  HP对克拉霉素的耐药     克拉霉素又名6-甲氧红霉素（甲红霉素），属于新一代大环内酯类药物。HP对克拉霉素的耐药率地区差异明显，各国为1%～13%不等。Glupczynski等［7］发现，儿童对克拉霉素的耐药率比成人高，这可能与儿童免疫力较成人低，而克拉霉素经常用于儿童呼吸道感染的治疗有关。HP对克拉霉素的耐药主要为23 SrRNA可变区基因的突变导致核糖体变构，克拉霉素结合位点随之发生改变，进而使HP与克拉霉素的亲合力减弱，不能阻止细菌的蛋白质合成，从而产生耐药性。但23 SrDNA的突变位点和突变形式却具有地区差异［8，9］。如中国东北地区，突变以G2224A，C2245T和T2289C为主，北京地区突变主要为A2143G［10］，上海地区突变在2144位。但总的来说，A2143G的突变最为常见且稳定，占突变的45.12%～82.11%，其它的突变形式有G2141A、A2142G、A2142C、A2142T、A2143C、G2115A，甚至在染色体的其它区段也发生突变。Fontana［11］等用PCR检测了12株耐克拉霉素菌株均未发现23 SrRNA基因上的2142位点和2143位点突变，却发现有7株耐药菌在23 SrRNA的恒定区发生了T2717C的突变，引起低水平耐药（MIC=1μg/ml）。

　　2.3  HP对β-内酰胺类药物的耐药      常用于抗HP 的β-内酰胺类药物为阿莫西林。β-内酰胺类药物是通过与细菌内膜靶蛋白青霉素结合蛋白（penicillin  binding proteins，PBPs）结合，使转肽酶失活，破坏细菌细胞膜的完整性，使细菌死亡。HP对阿莫西林的耐药率相对较低。以往研究认为，细菌对β-内酰胺类药物的耐药机理是：产生β-内酰胺酶、产生新的PBPs、药物作用PBPs的位点改变、细菌的渗透性降低以及自溶酶减少等。但是HP耐药菌株尚未检测到β-内酰胺酶，故推测HP对阿莫西林的耐药可能与其它机理有关。目前，已发现3种高分子量PBPs（PBP1、PBP2、PBP3）和6种低分子量PBPs，其中PBP1A上转肽酶结构域的4个氨基酸突变引起HP对阿莫西林低水平耐药（MIC<8μg/ml）［12］，PBP1A羧基端编码青霉素结合位点的10个氨基酸突变和细胞膜通透性改变，引起HP对阿莫西林中、高度耐药（MIC≥8μg/ml）［13，14］。Dore［15］研究也发现PBPs2D缺失是HP对阿莫西林耐药的原因。也有报道［12］，在阿莫西林耐药菌株的保守片段有4个PBP1的突变（S414R，Y484C，T541I和P600T）和1个PBP2突变（T498I），其中PBP2单独突变不能引起耐药，而PBP1单独突变能引起耐药，而两者一同突变并不能增强其耐药性。还有学者［14］认为多点突变可以导致耐药菌株的产生，Okamoto T［14］发现在两株突变菌株PBP1中的ORF（开放阅读框）都有4个氨基酸残基被替代和一个氨基酸残基的插入。

　　2.4  HP对喹诺酮类药物的耐药      喹诺酮类药物容易产生耐药，较少用于HP根除治疗。其耐药主要与DNA旋转酶（GYR）的改变和拓扑异构酶Ⅳ有关。DNA旋转酶由gyrA基因编码的2个A亚单位和gyrB基因编码的2个B亚单位组成的四聚体。此酶的主要功能是松解超螺旋DNA，使之能复制。对大肠埃希菌的研究发现，细菌对喹诺酮类的高度耐药由gyrA的突变引起，而低度耐药由gyrB突变引起。在对HP耐药菌株中也发现，gyrA基因有4个位点发生突变（Asn87→Lys、Ala88→Val、Asp91→Gly、Asn或Tyr取代、Ala97→Val取代），同时把耐药菌株的gyrA片段导入敏感菌株中从而使敏感菌株获得耐药性。因此，推论gyrA基因的突变是HP对喹诺酮类药物耐药的分子基础。

　　2.5  HP对利福霉素类药物的耐药  利福霉素类药物常用于抗结核病治疗，较少用于HP的治疗，该类抗生素对细菌的作用靶位是依赖DNA的RNA聚合酶，此酶由rpoB基因编码。Heep［16］经过一系列体外筛选获得了HP ATCC43504耐药株，对rpoB基因克隆、测序进行突变分析，发现所有耐药突变均包含密码子524-545和密码子586在内的基因簇区域。并发现利福平耐药株与野生型rpoB基因相同，只是在扩增54-916碱基对时，有一个密码子的改变，即V149→F。从耐药株扩增的rpoB基因片段导入到敏感株中，在选择培养基上长出了耐利福平的HP。从而推论，HP对利福霉素的耐药与rpoB可能有一定的关系。但确切的机理有待进一步研究证实。

　2.6  HP对四环素的耐药  四环素因其价廉有效而用于HP感染治疗，但近年来发现该药易引起二重感染，且其耐药率也呈上升趋势，现较少用于临床。四环素主要作用于细菌核蛋白体，阻止mRNA核蛋白体复合物A位与氨基酰tRNA的结合，从而抑制始动复合物的形成及肽链的延伸，并阻止核蛋白体与终止密码结合，抑制已合成的肽链或蛋白质释放。16 SrRNA的突变是HP对四环素耐药的主要原因，其中最常见的突变为16 SrRNA AGA（965～967）→TTC的突变。Nonaka等［17］证明16 SrRNA 965-967位，单个、两个或者三个碱基的突变都会导致HP对四环素的耐药，Wu JY等［18］也证明54%耐药菌株是单一位点突变（如CGA、GGA、TGA、AGC、AGT），这可能是由于这些碱基的改变，影响了16 SrRNA的结构所致。Lawson等［19］在1006株分离菌株中发现18株对四环素敏感性降低，其中有3株耐药（MIC≥4mg/L）；敏感性降低的18株中有10株检测到16 SrRNA突变：一株存在A926T和A928C的双重突变，一株A926C突变，一株A928C突变，另外七株为A926G突变。

　　3  结语   

目前，虽然对HP的耐药性有所研究并取得了一定的进展，但仍存在着许多问题，如耐药机理的不确定性；抗生素的使用剂量、用药史、年龄、性别等在HP对抗生素耐药中的确切作用仍不清楚。因此，加强临床菌株的耐药性研究，深入探讨HP耐药机理与特性，为指导临床合理用药以及抗生素的开发提供了新的思路。

作者：喻海忠，许国莹，陈巧林，陈建国，苏兆亮《右江民族医学院学报》

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