应用微生物改良法测定红细胞叶酸的研究

  摘 要  目的:研究微生物改良法测定红细胞叶酸（RCF）的可靠性。方法:用本方法检测不同疾病患者100例和健康自愿者50例的红细胞叶酸含量。对高、低两个质控标准的精密度、稳定性及实验相关性等指标进行评价。结果:本方法化学性能的评价表明:批内变异系数为2.228%和3.620%，批间变异系数为5.12%和7.51%。各厂家的试剂相关性良好（r=0.9544，n=50）。50名健康自愿者测定结果表明RCF的正常参考值为586.3±69.6ng/mL。结论:本方法测定结果准确、可靠且操作简便，实验条件简单，适宜于推广。

    关键词  红细胞叶酸;微生物改良法;巨幼细胞贫血

    血液中的叶酸水平异常偏低，除与叶酸缺乏的巨幼细胞贫血有关外，还与胎儿神经管缺陷有关，引起同型半胱氨酸血症，可影响血管功能和增加卒中危险。因而血液中的叶酸水平的检测受到高度重视。测定叶酸的方法基本上是微生物改良法和竞争结合两类，我们用微生物改良法对红细胞叶酸（RCF）进行了初步的研究。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1  菌株制备:购买耐氯霉素乳酸菌（NCIMB10463）冻干菌株。将冻干的菌株悬浮于5mL保养液37℃孵育18h后;混匀取1滴加入新的5mL保养液，37℃孵育18h（该菌株可以在-4℃保存2W，用于菌株的繁殖）后;混匀取0.5mL加入5mL保养液，37℃孵育6h后;用生理盐水清洗5次，最后用5mL生理盐水悬浮（简称清洗后6h菌株）。

    1.1.2  测量液:按培养基2.35g，氯霉素0.02g，V-C0.1g，Tween-80（1∶10稀释）0.1mL，去离子水100mL的比例配制，以5mL为单位分装。

    1.1.3  保养液:每升测量液中加标准叶酸10mL，按5mL/支分装于无菌带塞试管，置-20℃可保存1年。标准叶酸浓度:10ng/mL。

　　 1.3 测定样本

    ①定值高值质控标准=2.252ng/mL，低值质控标准=1.761ng/mL;分装后于-70℃保存，保证质控标准只冻融1次。②病人标本，不同疾病患者100例及健康自愿者50例，年龄25岁～40岁。所有标本均空腹，采肘静脉血2mL～3mL，置EDTA干燥管内，按1∶10比例稀释在1%的V-C液中（称V-C血）于-20℃贮存。

    2 微生物测定法

    2.1.  按表1和表2操作配制孵育试管。表1 标准曲线管孵育前配制表2 红细胞叶酸标本孵育前配制

    2.2.  上述试管在37℃孵育18h后，摇匀，用721-分光光度计（在波长λ=660mm处）比浊。以叶酸浓度为横轴，以光密度值（OD值）为纵轴做出标准曲线。试管1和试管2的OD值首先扣除同浓度空白对照管的OD值，然后由标准曲线查出该试管的叶酸值，标本的V-C血RCF（ng/mL）=（试管1叶酸值×0.04+试管2叶酸值×0.02）/2。标本的红细胞叶酸值（RCF）按以下公式进行计算:RCF（ng/mL）=［（V-C血RCF×10）/红细胞压积］ng/mL。

    3 结果

    3.1 精密度实验

    取高、低值质控血清，平行测定20次，计算批内CV，低值血清CV=2.228%，高值血清CV=3.620%。连续测20d，计算批间CV，低值血清CV=5.12%，高值血清CV=7.51%。

　　 3.2 稳定性实验

    按照菌株制备方法将冻干的菌株打开后，测定并绘制标准曲线图，测定高值、低值质控的RCF值;同时用保养液使菌株长期保存。并分别在第3d、7d、14d、20d、30d、50d、75d、100d使用保养液的菌株绘制标准曲线图，测定高值、低值质控的RCF值。高值质控的CV=5.18%、低值质控的CV=3.03%。

3.3 相关实验

    取50份标本同时用本法与美国DPC公司提供的进口的叶酸（固相非煮沸双相计数）放免试剂盒对RCF进行测定，相关系数r=0.9544。 3.4 正常参考值

    选取50名年龄在25岁～40岁健康人标本用本方法进行红细胞叶酸测定，用平均值±两个标准差的方法进行统计计算正常参考值，测定结果表明RCF的正常参考值为（586.3±69.6）ng/mL。

    4 讨论

    叶酸在体内代谢极为重要的单碳转运中起着关键性作用。血液中的叶酸缺乏除与巨幼细胞贫血有关外，还与胎儿神经管缺陷有关，引起同型半胱氨酸血症［1］ ，可影响血管功能和增加卒中危险 ［2，3］ 。由于红细胞内所含叶酸浓度比血清所含

    叶酸浓度高10倍～20倍，因而红细胞叶酸比血清叶酸更能代表组织内叶酸水平，当组织内叶酸水平已经缺乏，但尚未出现巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸的测定对叶酸缺乏作出的决定更有价值 ［4］ ;而且血清叶酸的结果易受多种因素的影响，如:炎症、肝病、肿瘤等 ［5］ 。因此虽然血清叶酸降低代表早期叶酸缺乏，但红细胞叶酸减低，不受外来因素的影响，确实反映了组织叶酸水平的减低。

测定叶酸的方法基本上是微生物改良法和竞争结合法两类，后者操作简单、灵敏、但是价格昂贵，目前国内多数用于测定血清叶酸（SF）。当肝肾功能受损时，叶酸可以聚合。这种聚合体用竞争结合法不能测定（除非这种聚合被解开）;但微生物改良法可以测定血液中总叶酸值（包括上述聚合体），因此用微生物改良法能满足临床测定肝、肾受损病人的总叶酸值。微生物改良法是经典的方法，材料来源广泛，并且用保养液可以使菌株长期保存。如果保存不当，致使菌株受杂菌污染或死亡，可以重新购买冻干菌株，十分简单便利地重新建立该实验;不需要购买特殊仪器;对仪器和实验条件要求较低;适用于大批标本测定。本实验观察了长期保存的菌株，其实验稳定性良好;与美国DPC公司提供的进口的叶酸（固相非煮沸双相计数）放免试剂相关性显著。因此便于在临床上推广使用。

作者：李建兰 杨波 冉家彦《长治医学院学报》

    参考文献

    ［1］ Siri PW，Verhoef P，Kok Fj.Vitamin B6，B12a and folate:Associ-ation with plasmatotal homocysteine and risk of coronary at herosclerosis［J］.J Am Coll Nutr，1998，17（5）:435～441.

    ［2］ Robinson K，Arheart K，Refsum H，et al.Low circulating folate and vitamin B6concentrations:risk factors for stroke，peripheral vascu-lar disease，and coronary artery disease［J］.Circulation，1998，97:437～443.

    ［3］ Morrison HI，Schaubel D，Desmeules M，et al.Serum folate and risk of fatal coronary heart disease ［J］.JAMA，1996，275:1893～1896.

    ［4］ Hill PW.Evaluntion of a commercial radioisotopic kitfor folate as-says.J Clin Pathol，1977，30:449.

［5］ 杨慧敏，陈觉凝，余灵，等.82名正常儿童红细胞叶酸、碱性铁蛋白水平测定及临床意义.中国小儿血液，1998，3:260.

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